在正常生理条件下，活性氧（ROS）的形成与内源性抗氧化清除化合物的去除之间存在平衡。当这种平衡被ROS不受控制的产生破坏时，就会发生氧化应激，包括超氧阴离子自由基（O²⁻）、羟基自由基（OH⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、单氧（¹O₂）和次氯酸（HOCl）。氧化应激导致过氧化物和自由基的积累，损害细胞和生物大分子，包括蛋白质、脂质和DNA，这将导致炎症性损伤、癌症和心血管疾病。在这些疾病中，肝细胞癌是世界上最常见的癌症之一，死亡率很高。

酚类化合物的许多合成抗氧化剂，如丁基化羟基苯甲醚（BHA），丁基化羟基甲苯（BHT）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）广泛用于食品工业。然而，它们的使用受到严格监管，因为在某些动物中高水平致癌作用较弱。近年来，通过酶水解从各种生物资源中释放出具有抗氧化活性的生物活性肽。从Sphyrna lewini，Dasyatis akjei和Raja porosa的软骨胶原蛋白水解物具有良好的1,1-二苯基-2-三硝基肼（DPPH），羟基自由基清除能力和三价铁离子还原性能。分子量低于3 kDa、疏水性能高的蓖麻蛹酶解肽表现出较强的DPPH自由基清除活性和螯合活性。此外，豌豆蛋白、小麦胚芽蛋白和大眼金枪鱼皮胶原蛋白肽表现出较强的抗氧化能力。

虽然几种抗肿瘤药物已被使用在临床上，但它们的副作用都严重包括胃肠道不适、肝肾损伤和身体抵抗力降低等。肽在癌症预防中因为它们分子量小具有许多独特的优势，例如临床安全性和高吸收性。近年来，对几种表现出抗肿瘤活性的生物活性肽进行了研究。分子量为3 kDa的酶促鳗鱼（单翅目）蛋白水解物在MCF-7细胞上的抗癌活性高于10 kDa和5 kDa蛋白水解物。油菜籽肽抑制Hela细胞生长，S期周期停滞和细胞凋亡诱导。李等发现玉米肽诱导人肝癌（HepG2）细胞细胞周期停滞和凋亡，并增强免疫系统以抑制携带H22的小鼠肝细胞癌。由分子量在390~1 400 Da之间的金枪鱼黑肌酶解产物制备的肽对MCF-7细胞具有显著的抗增殖活性。

胶原蛋白是动物结缔组织中最不溶的纤维蛋白。它在骨骼、皮肤、肌腱和软骨组织的独特生理功能中起着关键作用。胶原蛋白由于其良好的生物相容性和生物降解性，已广泛应用于食品、医药、生物医药、皮革、化妆品、细胞培养和组织工程等领域。研究人员对牛皮胶原蛋白在食品和包装中的制备和应用进行了研究。最近的研究发现，牛皮明胶的水解产物可以作为多磷酸盐的替代品，以提高热处理鸡的保水性和功能特性。添加牛皮明胶可提高牛肉饼的营养配比和抗氧化能力。然而，关于牛皮胶原蛋白肽的功能活性的研究很少。因此，本研究的目的是通过酶解法从牛皮胶原蛋白（BPCC）中转化生物活性肽，并研究其在HepG2细胞上的抗氧化活性和抗癌性能。

氨基酸分析

表1 BPCC的氨基酸组成

BPCC的抗氧化活性

为了评估BPCC的抗氧化活性，进行了ABTS，DPPH，羟基自由基清除和还原力测定。如图1A-C所示，DPPH、ABTS、羟基自由基清除活性均以剂量依赖性方式获得。在DPPH测定中，BPCC在0.4~2.0 mg/mL浓度下表现出最高的活性，从（30.60±2.61）%到（60.09±3.51）%。此外，BPCC在50~800 μg/mL浓度下显示出显著的ABTS从（32.50 ± 2.31）%到（77.40 ± 3.10）%，在0.5~2.5 mg/mL浓度下羟基自由基清除（41.20±1.60）%至（56.00±2.30）%。然而，随着BPCC浓度的增加，还原力先增大后降低（图1D），在1.5 mg/mL时，BPCC的最大还原力为0.032±0.025。相关研究表明，肽中氨基酸残基的组成是影响肽抗氧化活性的重要因素之一。Gly，Cys，His和Pro已被证明在某些肽的自由基清除能力中起重要作用。据报道，疏水氨基酸（Ala，Val，Met，Ile，Leu，Phe和Pro）具有明显的自由基清除作用。来自鸵鸟蛋清，阿拉斯加狭鳕（Theragra chalcogramma）框架蛋白，猪血红蛋白和鲈鱼（Decapterus maruadsi）肌肉蛋白的几种生物活性肽也报道了显著的抗氧化活性。

BPCC对蛋白质氧化损伤的抑制作用

图3. BPCC对（A）Cu²⁺/H₂O₂和（B）AAPH诱导的MBH蛋白氧化的保护作用。BPCC对（C）Cu²⁺/H₂O₂和（D）AAPH诱导的MLH蛋白氧化的保护作用。

BPCC对脂质氧化损伤的抑制作用

图4显示了羟基自由基和烷氧基自由基诱导的脂质过氧化。Cu²⁺/H₂O₂或H₂O₂的添加到MBH和MLH相对于对照组的脂质过氧化程度显著增加（P<0.01），表明该模型建立成功。然而，在Cu²⁺/H₂O₂和AAPH诱导的氧化损伤体系中，向MBH和MLH中加入不同浓度的BPCC显著降低了脂质过氧化程度，以不同程度的浓度依赖性方式降低。如图4A所示，Cu²⁺/H₂O₂诱导的MBH脂质过氧化的抑制程度达到（52.00±3.70）%，当浓度为15 mg/mL时。图4B说明，当浓度为8 mg/mL时，BPCC对AAPH诱导的脑过氧化的显著抑制作用为（52.02±2.92）%（P<0.01）。如图4C所示，当BPCC浓度为10 mg/mL时，肝组织中脂质过氧化的最大抑制作用为（48.60±3.75）%。从图4D可以看出，在6 mg/mL时，最高抑制率为（66.41±2.93）%。据推测，BPCC中疏水氨基酸的存在可能通过增加肽在脂质中的溶解度来促进脂质过氧化抑制活性，从而促进与自由基的更好相互作用。目前的结果表明，BPCC对肝脏过氧化有显著的抑制作用。在猪血红蛋白水解物、粥鳗蛋白水解物和鸭皮副产物肽中也发现了类似的发现。

图4. BPCC对（A）Cu²⁺/H₂O₂和（B）AAPH诱导的MBH脂质氧化的保护作用。BPCC对（C）Cu²⁺/H₂O₂和（D）AAPH诱导的MLH脂质氧化的保护作用。

BPCC对DNA氧化损伤的抑制作用

研究了BPCC（1.2~2.4 mg/mL）对Cu²⁺/H₂O₂诱导的pBR322质粒DNA的DNA损伤的保护作用（图5A）。如图5A所示，天然pBR322 DNA（对照组）大多处于超螺旋形式。然而，大部分pBR322 DNA在Cu²⁺/H₂O₂存在转变为开放的圆形。BPCC孵育后，DNA以剂量依赖性方式得到很好的保护。结果表明，BPCC具有阻止羟基自由基诱导的DNA损伤的能力。在短棒墨鱼肽和北鳕鱼肌肉蛋白水解物中也发现了类似的发现。

BPCC对AAPH诱导的pBR322 DNA损伤的保护作用如图5B所示，对照pBR322在AGE上显示超螺旋DNA带。然而，经AAPH（10 mmol/L）处理后，pBR322 DNA完全由超螺旋结构转变为开环结构，表明AAPH产生的含氧自由基引起了pBR322DNA的氧化损伤。BPCC显示出相当大的保护活性，产生的超螺旋质粒DNA条带。当BPCC浓度达到40 mg/mL时，超螺旋结构形式的pBR322DNA存在达到（89.50 ± 3.74）%。这些结果与其他关于几种蛋白质来源的研究相似，例如印度鱿鱼和尼罗罗非鱼水解物的蛋白质水解物。

图5. BPCC对（A）Cu2+/H2O2和（B）AAPH诱导的DNA损伤的保护作用

BPCC对HepG2细胞的抑制作用

本研究测定了不同浓度的BPCC（3、5、7、9和11 mg/mL）对HepG2细胞的抑制作用。如图6A所示，BPCC对HepG2细胞表现出剂量依赖性增殖抑制作用。最高浓度的BPCC（11 mg/mL）在细胞活力方面表现最显著的有效性（（22.22±1.83）%）。BPCC对HepG2细胞的IC₅₀值为7.61 mg/mL。上述结果表明，BPCC对HepG2细胞增殖表现出显著的抑制作用。BPCC处理的HepG2细胞的形态变化如图6B所示，作者发现用BPCC处理的细胞数量以浓度依赖性方式减少，正常组细胞轮廓清晰，具有代表性的不规则梭形形式，而BPCC处理后细胞形态发生变化。先前的报告证明，其他肽如玉米肽、高粱卡菲林水解物和燕麦蛋白衍生肽也对HepG2细胞表现出明显的抑制作用。

图 6.（A）BPCC对HepG2细胞活力的影响;（B）对照和处理过的HepG2细胞的细胞形态学变化。

DAPI和AO/EB染色

DAPI是一种荧光染料，可与细胞核结合并发出蓝色。在这项研究中，DAPI用于确定用BPCC处理的HepG2细胞的微观形态。如图7A所示，正常HepG2细胞用完整的核形态均匀染色，用DAPI染色的细胞在BPCC孵育后显示浓缩的细胞核和凋亡小体。

AO渗透所有细胞并使细胞核呈现绿色。EB仅被坏死细胞吸收，使细胞核变红，而活细胞核正常，呈均匀的绿色荧光。早期凋亡细胞具有鲜绿色的细胞核，形态变化明显，晚期凋亡细胞呈现浓缩和碎片化的橙红色染色质。因此，AO/EB双重染色通常用于区分正常细胞和凋亡细胞。如图7B所示，对照组的细胞核显示出均匀的绿色荧光，表明细胞健康且细胞核完整。然而，在BPCC处理的HepG2细胞中，绿光趋于减弱，红色逐渐增强，细胞表现出核收缩和染色质凝聚等凋亡特征。这些结果表明，BPCC诱导HepG2细胞凋亡。

图7.（A）孵育12小时后在荧光显微镜下诱导HepG2细胞凋亡的DAPI染色分析。（B）孵育12小时后在荧光显微镜下诱导HepG2细胞凋亡的AO/EB染色分析。

BPCC降低HepG2细胞的MMP

JC-1荧光的变化可以反映线粒体膜的相对偏振状态。红色荧光可归因于线粒体中潜在的依赖性聚集。线粒体膜去极化后，细胞质中的绿色荧光反映了JC-1单体的形式。没有完整膜电位的脱电线粒体不能将JC-1凝聚成聚集体。荧光显微镜图像如图8A所示，对照组JC-1发出红色荧光，而用3~7 mg/mL BPCC处理12 h的HepG2细胞红色荧光显著降低，绿色荧光增加。图8B显示用BPCC处理后HepG2细胞中红/绿荧光强度的剂量依赖性降低。上述结果证明了用BPCC处理的HepG2细胞中MMP的损失。

图8. MMP的JC-1分析

综上所述，BPCC对DPPH、ABTS和羟基自由基具有显著的清除活性，对蛋白质、脂质和DNA等生物大分子具有优异的还原力和对Cu²⁺/H₂O₂和AAPH诱导的氧化损伤的保护作用。BPCC以剂量依赖性方式抑制HepG2细胞的活力，通过细胞形态学、细胞核形态学的变化和BPCC处理的HepG2细胞MMP降低证实细胞凋亡介导的细胞死亡的诱导。这些结果将有助于广泛利用牛皮胶原蛋白肽，并开发与自由基相关慢性疾病相关的功能性食品。然而，BBPC的稳定性，生物利用度和安全性仍然未知。在开发功能性食品之前，应在这些领域进行未来的研究。

XIE Z K, ZHAI Y H, ZHANG Y Q, et al. Antioxidant and anti-HepG2 cell activities of a novel bioactive peptide from cowhide collagen in vitro[J]. Journal of Future Foods, 2024, 4(3): 248-257. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.07.007.