卵白蛋白（OVA）是蛋清蛋白中含量最高的蛋白质（约占54%），由385 个氨基酸组成（分子质量为45 kDa），是影响蛋清蛋白加工特性的主要物质。蛋白质和多糖之间的相互作用强度可以调控复合体系的结构，进而影响复合体系的透明度、稳定性和凝胶特性。岩藻多糖（FUC）是一种天然的硫酸化多糖，具有无毒和高生物相容性的特点，其碳链结构主要由含有硫酸基团的岩藻糖残基组成。FUC是一种高电荷的水溶性阴离子聚合物，在生物学和医学领域有着广泛的应用，OVA/FUC不仅可作为安全、大容量的载体用于靶向给药，还可作为具有生物活性的营养物质使用，在制备蛋白质纳米颗粒方面表现出充足的潜力。

吉林大学食品科学与工程学院的张婷、袁一心、尚晓敏*等人采用浊度滴定法、Zeta电位测量等分析方法，测定OVA/FUC复合体系在不同蛋白质/多糖复配比和盐浓度下的相行为变化，明确二者复合凝聚的临界pH值；利用圆二色光谱（CD）、荧光光谱和流变学等手段，解析FUC对蛋白构象和物性的影响，阐释OVA和FUC相互作用的机制。以期为理解硫酸化多糖与蛋白质相互作用机制奠定良好理论基础，并为开发基于硫酸化多糖/蛋白质复合凝聚体的功能性食品提供理论依据。

1 OVA/FUC复合凝聚相行为分析

1.1 pH值对OVA/FUC复合凝聚的影响

多糖和蛋白质之间产生复合凝聚现象是由于带相反电荷的生物聚合物之间的静电引力驱动。复合体系的pH值是决定生物聚合物表面电荷密度的关键。如图1所示，在酸性滴定过程中，OVA/FUC复合物的浊度明显高于OVA或FUC单一溶液，这主要归因于静电引力作用促进了蛋白质和多糖之间形成复合凝聚体。在酸滴定过程中单一的FUC溶液相对澄清，其浊度低且相对恒定，这归因于FUC分子表面的硫酸基团产生了抑制多糖分子间聚集的强静电斥力。OVA的浊度取决于pH值，在OVA的等电点（pH 4.72）附近达到最大。对于OVA/FUC复合物，有4 个关键的pH值临界点（pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2），pHc为浊度曲线斜率初次变化时的pH值，pHφ1是浊度曲线斜率突然增大时的pH值，pHmax是浊度达到峰值时的pH值，而pHφ2值是浊度曲线下降至稳定时的pH值。当pH＞pHc时，OVA与FUC在溶液中都带负电，由于复合物之间的静电排斥作用，OVA和FUC之间无法形成复合物（共溶区）。当pHφ1＜pH＜pHc时，复合溶液浊度开始增加，表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光线能力的可溶性复合物。当pH值高于蛋白质等电点时，依然可以通过静电相互作用形成可溶性复合物，这主要是蛋白质表面少量带正电的氨基酸与聚阴离子多糖带负电的硫酸基团相互作用的结果，也称之为“正电补丁”效应。随着进一步滴定，浊度急剧上升，当pH＜pHφ1时，出现明显的相分离，形成不溶性复合凝聚体。OVA和FUC之间的静电相互作用在pHmax时达到最强，导致不溶性OVA/FUC复合凝聚体的积累量达到最大。而后，随着pH值的不断降低，由于多糖的质子化，OVA/FUC复合凝聚物开始出现解离，乳浊液逐渐变澄清。但并未观察到OVA/FUC复合凝聚物完全解离（即未出现pHφ2）。主要原因在于含有硫酸基团的FUC酸解离常数（pKa）较低，在强酸条件下仍然未被全部质子化，因此即便在较低pH值时，OVA与FUC仍然存在强静电吸引力，较难解离。OVA/硫酸葡聚糖互作体系及OVA/果胶体系在酸化过程中均存在类似现象。

1.2 蛋白质/多糖复配比对复合凝聚相行为的影响

蛋白质/多糖复配比是影响复合物形成的关键因素之一，对复合体系的临界pH值影响显著。本研究进一步探讨了无盐添加条件下OVA/FUC复配比对复合凝聚体形成的影响。如图2所示，随着OVA/FUC质量比的增加（从1∶1增加至50∶1），OVA/FUC复合体系的浊度曲线逐渐趋于正态分布（图2a），临界pH值向更高pH值迁移（图2b）。当蛋白质/多糖质量比为1∶1时，复合溶液浊度较低，表明FUC处于过量状态，体系内蛋白分子可完全结合到糖链上，此时体系静电斥力较强，进一步抑制了蛋白质-蛋白质分子相互作用。当蛋白质/多糖质量比从5∶1增加到50∶1时，复合溶液的浊度曲线逐渐呈现先上升后下降的趋势，表明在较高蛋白质浓度条件下促进了复合凝聚体的形成，此时FUC糖链可结合多个OVA分子。图2c为不同蛋白质/多糖复配比复合凝聚物的外观，质量比为50∶1与20∶1的样品随着pH值降低出现了明显的宏观相分离，而在5∶1的体系中未观测到类似现象。相分离由热力学不相容而产生的排除体积效应影响，而非絮凝作用。综上所述，当OVA/FUC质量比为20∶1时，OVA和FUC的结合达到饱和，二者在复合凝聚过程中形成最稳定的复合凝聚体。

1.3 离子强度对OVA/FUC复合凝聚的影响

盐离子可通过静电屏蔽作用调控生物聚合物之间的相互作用。本实验以OVA/FUC质量比20∶1为条件制备复合溶液，分析NaCl浓度对OVA与FUC复合凝聚过程的影响。如图3a所示，随着NaCl浓度的增加，复合体系的浊度曲线在pH＜pHmax后逐渐趋于平缓。特别是当盐浓度大于50 mmol/L时，复合溶液的浊度曲线有一个较宽的平台期。当盐浓度大于200 mmol/L时，浊度由于强静电屏蔽效应而显著提升，溶液的表观形貌进一步证明了该变化趋势（图3a、c）。如图3b所示，随着盐浓度的增加，pHc与pHφ1均呈现先上升后下降的趋势，而pHmax在盐浓度提升至100 mmol/L时消失。这一现象可解释为在低盐浓度（0～100 mmol/L）条件下，盐离子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度，促进形成生物聚合物之间的静电引力，诱导凝聚体形成。在高盐浓度下，NaCl的竞争性吸附抑制了OVA和FUC之间的静电引力，导致临界pH值的降低。

2 OVA/FUC复合凝聚物的Zeta电位分析

不同盐浓度的OVA/FUC溶液（质量比为20∶1）中Zeta电位与pH值的关系如图4b所示。在不含NaCl的溶液中，OVA/FUC的等电点为4.07。盐离子的添加使复合物的等电点发生了轻微的左移，并且复合物的等电点随着溶液中NaCl的浓度升高而降低，这是由于NaCl的静电屏蔽作用。在较高的离子强度下（c（NaCl）≥100 mmol/L），过量的离子屏蔽了聚合物的带电活性位点，OVA和FUC之间的静电引力减少，这导致过多的硫酸基团无法与阳离子氨基基团结合。因此高NaCl浓度（c（NaCl）≥100 mmol/L）的复合溶液浊度在pH值小于OVA等电点时较高，且在低pH值时出现平台期。此外，在整个pH值范围内，OVA/FUC复合物Zeta电位绝对值与溶液中盐浓度的变化趋势相反。Zeta电位绝对的大小与系统的稳定性有关，因此高盐浓度会导致体系的稳定性降低。综上，静电相互作用为OVA/FUC凝聚体形成的主导力，且当复合物的浊度达到峰值（pHmax）时，OVA与FUC带有相反电荷。

3 OVA/FUC复合体内蛋白质构象解析

3.1 内源荧光光谱分析

为进一步分析OVA与FUC复合凝聚过程中二者之间相互作用的分子机制，测定在pH 6.0与pH 4.5条件下不同比例OVA/FUC复合物的蛋白质二级结构变化，结果如图6所示。蛋白质中α-螺旋的特征峰位于约208 nm和222 nm波长处，β-折叠和β-转角的特征峰位于约216 nm和206 nm波长处。如图6a、b所示，单一OVA的光谱峰值位于约222 nm，FUC的加入使所有样品的光谱峰发生了不同程度的蓝移，表明OVA/FUC复合物中蛋白质分子的二级结构发生了变化。在pH 6.0的复合溶液中，少量FUC的加入降低了OVA光谱峰的强度（质量比≥10∶1）。相反，过量的FUC会导致OVA光谱的峰值增大（质量比＜10∶1）。而当复合溶液的pH值为4.5时，任何添加量的FUC均会使OVA光谱峰的强度降低，此时OVA的二级结构发生显著变化。由此可见，FUC的复合凝聚改变了OVA的二级结构构象（α-螺旋与β-折叠）。

为了进一步量化FUC复合对OVA二级结构的影响，使用BESTSEL软件分析了蛋白质二级结构的含量，结果如图6c、d所示。当pH 6.0时，FUC的添加对OVA的二级结构的影响不显著。当pH 4.5时，FUC的存在使OVA的α-螺旋含量下降而β-折叠含量上升，这表明添加FUC后OVA分子发生了一定程度的解螺旋。此外，FUC对OVA的解螺旋效应在50∶1时达到最大值，而在1∶1时达到最小值，该变化归因于溶液中过量的阴离子对OVA二级结构变化的抑制作用。Zhang Ting等在蛋清蛋白与硫酸葡聚糖的相互作用研究中也发现了类似现象。Tang Honggang等同样发现带有硫酸基团卡拉胶的复合作用促进了蛋清蛋白分子α-螺旋向β-折叠的转变。然而大量研究表明，除硫酸化多糖外的其他阴离子多糖（如羧甲基纤维素）与蛋白质的静电复合对蛋白质的二级结构无显著影响，这一现象可能与多糖中的硫酸基团有关。

4 OVA/FUC复合凝聚体流变学特性分析

为更深入地了解OVA/FUC凝聚体的宏观特性，利用频率扫描进一步探究了在pH 4.5条件下NaCl浓度和OVA/FUC质量比对凝聚体黏弹性的影响。储能模量（G’）反映复合体系的黏弹性，是溶液中大分子相互交联形成大尺寸聚集体的结果。如图7a所示，复合溶液的G’随着FUC的添加呈现先上升后下降的趋势，且在OVA/FUC质量比为20∶1时达到最大值，表明在该条件下复合溶液中蛋白质分子间的交联程度达到最大，聚集体的尺寸达到最大。相反，当质量比为5∶1或1∶1时，OVA/FUC复合物的G’远低于OVA，这一结果与相行为结果基本相符，此条件下的OVA/FUC复合物处于可溶性复合凝聚阶段和共溶阶段，体系中大量的聚阴离子阻碍了蛋白质分子的进一步聚集。Niu Fuge等研究表明，由于空间位阻效应，高度支化的多糖在混合体系中比线性大分子难以形成交联结构。因此，过多的FUC削弱了复合体的复合凝聚过程中的聚集行为。不同盐浓度下的流变结果表明，随着盐浓度的增加，样品的G’呈现先减小后增加的趋势（图7b）。这可能是由于在pH 4.5溶液体系中少量盐的加入会抑制OVA与FUC之间的相互作用，削弱复合物的相互交联。在50 mmol/L的NaCl浓度下，体系的G’最低。然而，当NaCl浓度达到400 mmol/L时，OVA/FUC凝聚体的G’达到最大值。这可能是由于高盐促进了OVA分子的变性，从而促进了OVA分子间的聚集。这些结果与浊度和Zeta电位随离子强度的变化基本一致。综上所述，体系中过量蛋白质或多糖的存在影响凝聚体的G’，这归因于体系的排斥力和空间位阻效应。当蛋白质/多糖结合接近饱和时，复合体系作为一个电中性的整体，分子间排斥力最小，导致OVA/FUC质量比为20∶1的复合物表现出最高的G’。

结 论

本实验探究了pH值、离子强度和生物聚合物质量比对OVA和FUC复凝聚相行为的影响。随着OVA/FUC复配比的增加，可以与FUC结合的OVA分子数量增加，复合物的临界pH值（pHc和pHφ1）向高pH值方向移动。当OVA/FUC的质量比从1∶1增加到5∶1时，由于OVA和FUC之间强烈的静电相互作用，没有出现明显的pHmax。形成复合物的最佳OVA/FUC质量比是20∶1，它表现出最高的浊度，且具有较高的储能模量。OVA和FUC之间的静电相互作用具有显著的盐离子依赖性。当盐的浓度小于100 mmol/L时，复合物的临界pH值向更高的pH值方向移动，表明低盐离子浓度可促进复合凝聚体的形成。然而当盐浓度大于100 mmol/L时，静电屏蔽效应会改变OVA与FUC之间的静电复合状态，临界pH值显著下降。同时，FUC的加入改变了OVA蛋白质的分子构象，促进了OVA的解螺旋和三级结构的展开。综上所述，通过改变OVA和FUC溶液的复合条件可以调控二者的复合凝聚特性，本研究可为设计基于OVA/FUC复合物的新型水凝胶和功能性纳米载体奠定理论基础。

本文《基于静电相互作用的卵白蛋白与岩藻多糖相行为分析及流变学分析》来源于《食品科学》2024年45卷第9期51-59页，作者：张婷，袁一心，嵇竞弘，龚泠灵，吴昕玲，刘静波，尚晓敏。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230607-061。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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