• 通过优化还原、烷基化、消化和纯化等步骤，建立了鉴定多肽标记物的快速样品制备方法
• 在快速样品制备过程中，可以检测到大多数提供物种特异性肽的蛋白质
• 建立了检测7种动物的35种物种特异性肽的快速LC-MS/MS方法

由于过去几年世界范围内出现了许多食品欺诈和不良行为，食品的真实性逐渐成为食品安全和质量的焦点。加工肉制品的掺假现象尤为严重，因为碎肉的成分很容易被无标注的肉种所替代。在肉制品中添加和替换未标注的肉种可能构成商业欺诈，损害消费者和破坏食品市场秩序。因此，需要快速、灵敏、可靠的分析方法来鉴定肉制品中的多个肉种。

对于含有多种哺乳动物和家禽物种的高度加工的肉类产品，使用质谱法（MS）检测特异性肽是一种强大的、高通量的肉类认证方法。猪肉特异性肽可以成为区分猪肉与牛肉、山羊肉和鸡肉的标志物。此外，使用串联质谱法（MS/MS）可以检测到牛肉中0.55%的猪肉和加工牛肉中0.24%的猪肉。牛肉和猪肉也可以在复杂和高度加工的食品系统中被量化，如肉酱。羊肉也可以用多反应监测（MRM）质谱法通过选定的肽标记物来识别，1%（m/ m）的猪肉、牛肉和马肉的添加量可以被区分出来。对鹿肉鉴定的特异性多肽检测相对来说进行得较少。鸡、鸭和火鸡是被广泛消费的家禽物种，可以通过基于物种特异性肽的分析方法进行鉴定。

用于物种鉴定的肽标记物检测策略是基于自下而上的蛋白质组学，其特点是对蛋白质中的特定肽键进行酶切。在蛋白质消化方法中，“在溶液中”是最经常使用的，因为其实验过程没有复杂的蛋白质分离操作。然而，样品的准备需要几个小时到一夜的时间：消化前的二硫苏糖醇（DTT）还原二硫键和碘乙酰胺（IAA）硫醇烷基化的步骤通常需要1.5～2.5 h；而消化的时间为4～24 h，典型的消化条件是过夜（12～18 h）。因此，由于样品制备步骤复杂，反应时间长，该方法在实际肉制品中的物种鉴定应用受到限制。

在本研究中，中国肉类食品综合研究中心的Mingyue Zhang、Shouwei Wang等通过优化还原、烷基化、消化和纯化等步骤，将处理时间从过夜缩短到2.5 h，建立了一个简单而快速的样品制备程序。并将其应用于开发一种快速LC-MS/MS方法，以识别7种动物的物种特异性肽，用于肉和肉制品的认证，使处理时间从接收样品到获得结果在3 h之内。

7种生肉中的蛋白质浓度表明，该方法的蛋白质提取是充分的。在消化之前，二硫键的还原和硫醇的烷基化是传统样品制备方法中不可避免的步骤，但这些程序通常是不完整的，容易产生副反应。溶液中过多的IAA会与氨基酸的N端NH₂和C端羧酸基团反应，产生的副产品可能会干扰最终的蛋白质分析。一项研究表明，还原和烷基化并不能提高蛋白质组学定量的质量，在保护硫醇不被氧化的条件下多识别10%～20%的肽和蛋白质。这为简化还原和烷基化的程序以减少反应时间，同时保持肽的数量和质量提供了可能。因此，本研究比较了用传统方法和跳过还原和烷基化步骤的相同程序处理的7个样品的肽含量。每个物种的平均肽含量（N = 3）被单独归一到两种方法的最高含量（＝100%；表1）。在没有还原和烷基化步骤的情况下，获得了每个物种80%以上的预期多肽，羊和鹿物种的多肽含量超过90%。结果表明，跳过还原和烷基化步骤的样品制备是可行的，可以获得7种生肉中绝大多数的肽。

不进行还原和烷基化，从肉类样品中提取的蛋白质可直接被胰蛋白酶消化。碳酸氢铵可以作为蛋白质提取的缓冲剂和胰蛋白酶消化的缓冲剂。因此，加入2 mL 1%的碳酸氢铵溶液，以稀释反应溶剂而不干扰消化。消化后，在样品中加入100 μL 10% FA/H₂O溶液以终止消化，而不影响MS信号的质量。此外，反应液的杂质相对较少，蛋白质提取物用碳酸氢铵稀释。因此，用12000 r/min离心10 min的方法代替脱盐，以简化程序。

在确认了快速样品制备的步骤后，对上清液和胰蛋白酶的量以及消化的时间进行了评估，以尽量减少时间和试剂消耗。在4组条件下，用不同量的提取物上清液（200、100、50 μL）和胰蛋白酶溶液（60、30、10 μL）通过RSP，消化2 h，测量7个物种的肽含量，并分别归一到最高含量（＝100%；表1），以反映消化的结果和胰蛋白酶的活性。50 μL和100 μL的上清液等分在每个物种中产生了在原始条件下（200 μL的上清液，60 μL的胰蛋白酶）获得的约四分之一和一半的肽。上清液的最佳等分量被设定为100 μL，因为它应该是尽可能少的，当上清液量不足时，一些肉制品的肽含量可能太少，无法进行蛋白质组学分析。胰蛋白酶的用量只对肽的含量略有影响，30 μL的胰蛋白酶溶液（1 mg/mL）足以消化100 μL上清液中的蛋白质。胰蛋白酶消化是传统样品制备中最核心、最耗时的步骤。7个样品消化1、2、4 h后的肽含量也分别归一到表1中的最高含量（＝100%）（其他条件被设定为RSP中的最佳参数）。4种生肉（猪、牛、羊、鸡）的肽含量在消化2 h后达到最大值，其他样品的肽含量也达到最大值的90%以上。因此，2 h是合适的消化时间。

传统样品制备方法和RSP方法下7个物种的蛋白质比较

在验证了RSP方法产生足够多的肽的能力后，比较了通过传统的样品制备方法和RSP方法对7个物种的生肉样品的识别蛋白质数据，以研究RSP方法获得的蛋白质的质量。每个肉类样品通过高分辨率质谱分析法进行一式两份分析。只有当每个物种的两个样品被确认时，才接受对蛋白质进行统计分析。经确认属于各自物种的已鉴定蛋白质的错误发现率小于1%。

如图2所示，7个动物物种的鉴定蛋白分布在3种情况下，即RSP方法中唯一发现，传统方法中唯一发现，两种方法中同时发现。通常检测到的蛋白质的分子量集中在20～60 kDa之间。在RSP方法下，所有分子量的蛋白质都能被检测到。此外，猪肉和鹿肉中大分子量的蛋白质用RSP方法比用传统方法更容易检测出来。就鉴定的蛋白质数量而言，每个物种60%以上的蛋白质在两种方法中同时被检测到。71%的羊肉鉴定蛋白、72%的鸭肉鉴定蛋白和73%的火鸡鉴定蛋白在两种方法中都有发现。每个物种仅在RSP方法中鉴定的蛋白质数量大于仅在传统方法中鉴定的蛋白质数量，除火鸡的数量相等。这一结果表明，在传统方法中检测到的大部分蛋白质也可以在RSP方法中被检测到，并且在RSP方法中可以发现比传统方法中更多的蛋白质。

RSP法筛选和验证7个物种的特异性多肽

在确认了RSP方法的有效性后，建立了涉及RSP方法的快速LC-MS/MS检测特定物种肽的方法。三重四极杆质谱的MRM因其灵敏度高和动态范围满足复杂食品基质等高要求的应用而被普遍用于肽的定性和定量分析。因此，首先用高分辨质谱对猪、牛、羊、鹿、鸡、鸭和火鸡的特异性多肽进行筛选，然后通过转换为相应的MRM离子导入LC-MS/MS中。之后，在模拟的肉类样品中验证了快速LC-MS/MS方法。

物种特异性多肽的筛选

对7个物种的生肉样品中从QE分析中提取的多肽进行筛选，根据以下参数选择物种特异性多肽：1）每个物种都有唯一的检测结果；2）长度在6～25个氨基酸残基之间；3）两端都有胰蛋白酶特异性裂解位点，没有遗漏裂解；4）在肌肉中含量丰富。此后，使用Uniprot BLAST排列研究工具（https://www.uniprot.org/blast/）再次检查这些被筛选的肽的序列，以确定其物种特异性。只有100%相同的氨基酸序列才被认为是与肽相匹配的，而且只有与相应物种单独匹配的肽才被认为是物种特异性的。

对自制肉类样品的验证实验旨在确认所选肽标记物在食品加工后的热稳定性，如煮沸、消毒、油炸和烘烤。模拟肉样品是由7个物种的纯肉通过以下4种热处理得到的：1）100 ℃煮沸30 min；2）121 ℃高温杀菌30 min；3）油炸5 min；4）200 ℃烘烤30 min。采用快速LC-MS/MS方法对这4组热处理的肉类样品进行了多肽标记物的检测，在模拟样品中发现了相应物种特异性多肽的MS信号。