食品界

中国农业科学院：转录因子 MdWRKY32 与MdBam5 启动子结合参与苹果贮藏期间的淀粉-糖代谢

苹果是中国北方地区重要的种植果树，产量和出口量均居全球首位。苹果果实后熟过程中淀粉迅速降解并转化为糖，同时果实明显软化。虽然淀粉降解在部分淀粉型果实中已经开始研究，但是苹果果实采后成熟过程中的淀粉降解还存在很多未知。前人研究表明β-淀粉酶对苹果果实淀粉降解起到至关重要的作用，但是对采后淀粉降解起特异作用的β-淀粉酶基因还并未鉴定到。为了解决上述问题，中国农业科学院农产品加工研究所农产品保鲜与物流创新团队李昂、陈静、林琼*、段玉权*、赵垚垚等人用实时荧光定量、酵母单杂交、GUS 报告基因活性检测、瞬时过表达等实验技术体系，筛选对苹果采后淀粉降解起关键作用的β-淀粉酶基因家族成员，并初步对该基因的转录调控机制开展相应的研究。该研究结果以“Transcription Factor MdWRKY32 Participates in Starch−Sugar Metabolism by Binding to the MdBam5 Promoter in Apples During Postharvest Storage”为题发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry（https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c03343）上。

1. 研究主要内容

1）不同处理对苹果采后生理指标的影响

本研究对不同温度、乙烯和1-MCP处理下苹果果实在采后贮藏过程中的失重率、硬度、呼吸速率和乙烯释放速率等参数进行了测量。结果表明，在所有处理过程中，苹果果实的失重率持续增加，硬度呈现出下降的趋势（Figure 1 A、B、E、F）。在贮藏过程中，4 ℃下贮藏的水果与20 ℃下贮藏的水果相比硬度更高，失重率更低。与对照组相比，1-MCP处理减缓了质量的损失并在贮藏期间保持了水果的硬度。然而，经乙烯处理的果实和对照果实相比，在重量和硬度上均未观察到显著差异。在20 ℃下贮藏的果实呼吸速率和乙烯产量增加，分别在贮藏14 d和21 d达到最大值（Figure 1 C、D），乙烯处理的果实在储存14 d时达到了乙烯高峰，该峰比对照果实的乙烯峰更高，且发生时间更早（Figure 1H）。相比之下，1-MCP的处理延迟了成熟，经1-MCP处理的果实在整个贮藏期间，呼吸速率和乙烯的生成都无法检测到。

2）不同处理对苹果淀粉及可溶性糖含量的影响

淀粉降解是采后成熟的迹象，并有助于苹果果实中的可溶性糖积累。在整个贮藏期间，20 °C条件下贮藏的果实淀粉含量迅速下降，在贮藏的第28天时达到4.3 g kg^-1（Figure 2A、B）。从采后贮藏的0 d到14 d可溶性糖含量增加，然后在贮藏的21 d开始下降（Figure 2C）。与在20 °C条件下贮藏的果实相比，4 °C条件下贮藏的果实中淀粉和可溶性糖含量较为稳定。乙烯和1-MCP处理的果实中淀粉含量的降低表现出相似的成熟模式（Figure2 D、E），与对照相比，1-MCP处理在贮藏7 d至28 d时保持较高的淀粉含量和较低的可溶性糖含量，并且在贮藏14 d时淀粉和可溶性糖含量差异显著。与对照相比，乙烯处理降了贮藏期间的淀粉含量并增加了可溶性糖含量，但未观察到显著差异。

3）β-淀粉酶基因家族成员在四种成熟过程中的表达变化为了深入了解β-淀粉酶基因家族在苹果果实采后淀粉降解中的作用，对四种成熟过程中的β-淀粉酶基因家族进行基因相对表达量的测定。如Figure 3A和Figure 3B所示，在四种成熟过程中，20 个β-淀粉酶基因家族成员在此阶段有所表达。在不同温度处理的苹果果实中，有5 个成员（MdBam5、MdBam8、MdBam13、MdBam15和MdBam16）的基因相对表达量受到20 ℃的诱导，并受到4 ℃的显著抑制，与果实淀粉和糖含量的变化趋势一致（Figure 3A）。而MdBam6、MdBam7、MdBam10、MdBam11和MdBam17基因相对表达量的变化趋势则与之相反，受到4 ℃的诱导，与淀粉和糖含量的变化相悖。

有5个成员（MdBam5、MdBam6、MdBam8、MdBam14和MdBam19）的基因表达迅速响应外源乙烯处理诱导并受1-MCP处理抑制，在乙烯释放高峰出现的第21天前就出现峰值，随后降低至与对照和1-MCP处理类似的水平（Figure 3B）。最后，基于基因的表达丰度以及不同处理间的显著性，从以上的成员中确定MdBam5基因可能和苹果果实淀粉降解有这密切关系。因此，我们对该基因进行下一步深入的研究。

4）MdBam5 的瞬时过表达分

“王林”苹果果肉有着较高的渗透性，并且果肉中含有大量的淀粉以便于染色观察，因此我们利用“王林”果肉瞬时过表达实验来验证 MdBam5 基因的功能。以空载体注射的果肉为对照，MdBam5重组SK载体为实验组（Figure 4A）。果实切面的淀粉可与碘-碘化钾反应呈蓝黑色，与对照相比，在瞬时过表MdBam5 果实的注射部位蓝黑色面积更小（Figure 4B），收集过表达 MdBam5的果肉和对照区域果肉，以测量淀粉含量。结果表明，过表达MdBam5 果肉的淀粉含量低于对照的淀粉含量（Figure 4C），这表明MdBam5 促进了“王林”果实中的淀粉降解。

5) MdWRKY32转录因子与MdBam5 启动子的顺式作用元件结

通过 Plant-Care 网站分析鉴定得到的苹果采后淀粉降解关键β-淀粉酶基因家族成员MdBam5 启动子的顺式作用元件，结果显示位于起始密码子上游-183 bp 的位置含有一个WRKY 转录因子结合位点 W-box（Figure 5A）。因而推测，WRKY 转录因子可能结合在该W-box 顺式作用元件处。将 MdBam5 启动子上 W-Box 顺式作用元件串联重复三次，整合到酵母基因组中，采用不同浓度的 AbA 来抑制启动子的自激活。结果表明 100 ng mL^-1的AbA 可以抑制启动子自激活，因此后续实验采用 AbA 浓度为 100 ng mL^-1（Figure 5B）。利用MdBam5启动子开展筛库实验，最终获得29 个阳性克隆，将测序结果输入NCBI数据库中进行比对，其中包括一个MdWRKY32转录因子。进一步进行酵母单杂交一对一验证实验，转入空载的MdBam5 promoter的酵母在含有 100 ng mL^-1AbA 的缺陷型（-Leu）培养基上不能生长。将 MdWRKY32 转入含有 MdBam5 promoter 的酵母中就可以使其在相同的培养基上生长。上述结果表明，在酵母体内 MdWRKY32可以直接与MdBam5启动子结合（Figure 5C）。

为了进一步研究 MdWRKY32 对 MdBam5的调控模式进行 GUS 报告基因试验。将MdBam5启动子连到含有报告基因 GUS 的载体上，构建 PMdBam5::GUS 载体和35S::MdWRKY32 载体（Figure 5D），分别导入到农杆菌中注射苹果果肉，通过 GUS 染色以及测定 GUS 报告基因的荧光强度，结果显示，与单独携带 PMdBam5::GUS 的果肉相比，包含 PMdBam5::GUS 和 35S::MdWRKY32 的瞬时过表达果肉表现出更高的 GUS 活性（Figure 5E），这表明 MdWRKY32 促进了MdBam5启动子的活性。

6）MdWRKY32 在淀粉降解过程中的功能验证基因表达结果表明，4 ℃低温贮藏过程中MdWRKY32表达被显著抑制（Figure 6B），而通过乙烯处理诱导了MdWRKY32的表达，其表达在贮藏7 d达到峰值，然后在贮藏21 d降至与对照和1-MCP处理的相似基础水平（Figure 6A）。除此之外，MdBam5和MdWRKY32的表达对乙烯和低温表现出相似的响应，并与淀粉降解和糖分积累的成熟行为平行（Figure 2）。

为了进一步确认MdWRKY32对淀粉降解的作用，将其全长CDS序列构建到SK载体上，在普通烟草叶片中进行过表达。结果表明，过量表达MdWRKY32的烟草叶片中淀粉含量明显低于对照，降低45.16 %（Figure 6C），表明MdWRKY32 能够促进淀粉的降解。

2.结论

通过对苹果失重率、硬度、乙烯释放速率、淀粉含量以及可溶性糖含量等生理指标的测定，发现苹果采后成熟过程中果实淀粉降解被乙烯处理促进并受到1-MCP及低温处理的抑制。乙烯可以加速苹果果肉淀粉降解过程，提高可溶性糖含量，而低温和1-MCP处理则与之相反。荧光定量PCR和瞬时过表达实验表明，MdBam5基因的表达与苹果果实淀粉降解密切相关。我们以MdBam5启动子为饵进行酵母单杂筛库实验，得到一个MdWRKY32转录因子，其表达模式与MdBam5相似，都受到乙烯的诱导以及低温和1-MCP处理的抑制，并与淀粉降解和糖分积累的成熟行为平行，而且瞬时过表达MdWRKY32的烟草叶片淀粉含量与对照相比明显下降。最后利用GUS报告基因活性检测实验，验证了MdWRKY32是乙烯诱导上调表达的转录激活子，能结合并激活MdBam5的启动子，促进MdBam5的表达，从而促进果实淀粉降解。

通讯作者简

林琼副研究员

林琼，中国农业科学院农产品加工研究所副研究员，硕士生导师，荷兰瓦赫宁根大学访问学者，主要从事果蔬采后品质调控与贮运保鲜，果蔬采后淀粉-糖代谢机理及其控制技术，特色果蔬及鲜切产品保鲜技术开发。先后主持或参加国家自然科学基金面上项目、青年基金、国家“十三五”计划重点研发专项子课题、农业行业标准及企业合作项目等10余项。发表学术论文30余篇；获得授权国家发明专利18 项、实用新型专利6 项；主编著作2 部，参编3 部；参与制定农业行业标准2 项。

段玉权研究员

段玉权，博士，2002年毕业于中国农业大学食品学院，中国农业科学院农产品加工研究所第2届、第3届学术委员会委员，农产品冷链物流标准化技术委员会委员、国家农产品加工技术研发体系蔬菜专业委员会专家委员、中国物流学会理事、中关村冷链物流联盟专家委员。长期从事生鲜果蔬贮藏保鲜与加工理论与应用技术研究工作，先后主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发专项、农业部公益性专项和财政专项、中国农科院院级基本科研业务费等省部级科研项目20余项，发表科研论文60余篇，获得国家发明专利20余项，主持2项农业行业标准，主编科技著作3部，参编著作14部，获农业部中华农业科技奖一等奖2项、中国粮油学会科技一等奖1项，中国农业科学院科技成果一等奖1项。参加了国家发展改革委《农产品冷链物流规划》、科技部《国家中长期科技发展规划纲要》、农业农村部《农产品加工与农村一二三产业融合发展规划》等规划编制工作。

文章及图片来源于中国农业科学院农产品加工研究所农产品保鲜与物流创新团队。