食品界

江南大学孙嘉教授等：表达鼠源β-防御素14的植物乳植杆菌减轻小鼠急性结肠炎

炎症性肠病（IBD）是特发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn’s disease）和溃疡性结肠炎（UC）。近年来，该疾病的发病率迅速上升，其全球发病率超过0.3%。除遗传因素外，环境因素在IBD的发病机制中起着关键作用，大多数环境因素主要通过影响肠道菌群从而介导IBD的发病过程，如西方饮食的长期摄入会破坏肠道菌群平衡，降低菌群多样性，肠道菌群及其代谢产物刺激先天免疫细胞的激活，引起肠道炎症反应的发生，从而损伤肠道上皮屏障，导致细菌易位，并进一步刺激炎症反应发生，加速IBD的发生发展。

植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是国家卫生部《可食用的菌种名单》中列出的益生菌之一，被广泛应用于肠道炎症的干预研究，其可黏附在肠道黏膜上并存活数天，是表达生物活性物质的良好载体。故本实验选取植物乳植杆菌为载体构建重组菌株，通过Usp45分泌信号驱动hBD3直系同源蛋白鼠源β-防御素14（mBD14）的分泌，实现mBD14在小鼠结肠中的靶向递送。江南大学食品学院的陈小培、田海芝、孙嘉*等旨在揭示表达mBD14的重组植物乳植杆菌在葡聚糖硫酸钠盐（DSS）诱发的小鼠结肠炎中的作用及其潜在机制，评估益生菌和抗菌肽在UC中的作用，为IBD防治提供新策略。

1、mBD14生产菌L. plantarum/mBD14的构建及mBD14的表达

本实验选择Usp45作为分泌信号肽，Usp45与外源蛋白序列或肽连接时可促进它们分泌到胞外。Usp45-Linker-mBD14融合基因经限制性内切酶酶切后嵌入pNZ8148质粒的SphI和XbaI位点，得到质粒pNZ8148-mBD14，将该质粒电转入植物乳植杆菌感受态细胞中得到L. plantarum/mBD14（图1A）。在含有氯霉素（质量浓度5 μg/L）的MRS固体培养基上涂布菌液，培养后得到的单菌落即阳性转化子（图1B）。挑取单个菌落，经培养后提取质粒，通过PCR检测mBD14基因片段的表达，可见大小约382 bp的扩增条带，与含融合基因的穿刺菌质粒PCR结果一致（图1C）。同时，Western blot和抑菌圈实验表明L. plantarum/mBD14能够表达和分泌mBD14蛋白，且mBD14蛋白不会影响其载体植物乳植杆菌的生长（图1D、E）

2、L. plantarum/mBD14对小鼠结肠炎症状的缓解作用

用DSS处理小鼠7 d后，观察到与Control组相比，未进行细菌预处理的DSS组小鼠体质量显著下降（图2A），DAI评分显著增加（图2B）。结肠缩短也是小鼠结肠炎模型的关键病理事件之一。对所有小鼠解剖后测量其结肠长度，发现DSS组小鼠的结肠明显变短，进一步证明小鼠结肠炎模型建立成功。在诱导结肠炎前，分别给予小鼠L. plantarum、L. plantarum/0和L. plantarum/mBD14进行预处理，结果显示，与DSS组相比，L. plantarum/mBD14能够显著改善体质量的减轻（P＜0.05），降低DAI评分和缓解结肠缩短，而摄入L. plantarum和L. plantarum/0的小鼠与DSS组小鼠相比，DAI评分和结肠长度未表现出明显差异（图2B、C）。实验结果表明L. plantarum/mBD14能够缓解由DSS诱导的结肠炎，而两种对照菌株无明显保护作用。

3、L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠肠道菌群的调节作用

结果如图3所示，小鼠经过DSS处理后，结肠内致病菌大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌相对丰度显著增加（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.01），下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著降低（P＜0.05），与临床上IBD患者的变化一致。相比于DSS组，L. plantarum/mBD14预处理组小鼠结肠内嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著升高（P＜0.05），而大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌相对丰度出现显著下降趋势（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.01），其相对丰度均接近于Control组，且L. plantarum和L. plantarum/0预处理能够显著抑制大肠杆菌和具核梭杆菌的增加（P＜0.001、P＜0.05）。本实验表明L. plantarum/mBD14能够显著抑制DSS诱导的多种致病性细菌富集，维持小鼠结肠内肠道菌群平衡。

4、L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠肠道损伤的保护作用

通过H&E染色对小鼠结肠组织进行组织病理学分析，发现DSS组表现出严重的结肠组织损伤，其隐窝结构明显消失，结肠组织周围水肿，免疫细胞浸润，且DSS处理小鼠的组织病理学评分均高度显著高于Control组（P＜0.001）。经L. plantarum/mBD14预处理小鼠的结肠组织切片有明显改善，可见其结肠形态变化和炎症浸润减少（图4A），且组织学评分在所有摄入DSS的处理组中最低（图4B）。此外，有研究表明，DSS诱导的结肠炎会带来肠道屏障功能的损伤，并出现肠道通透性增加、紧密连接蛋白表达下调等现象。通过检测小鼠血清中FITC-Dextran的质量浓度来评估小鼠的肠道通透性。

如图4C所示，与Control组相比，DSS组小鼠血清中FITC-Dextran质量浓度显著升高（P＜0.05），而L. plantarum/mBD14预处理组与DSS组相比FITC-Dextran质量浓度显著降低（P＜0.05），表明L. plantarum/mBD14能够维持肠道完整性，使FITC-Dextran无法渗透进入血液。紧密连接蛋白在维持肠屏障功能中发挥着关键作用，通过Western blot检测紧密连接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表达情况来进一步验证L. plantarum/mBD14对肠道屏障功能的保护作用。

如图4D所示，与DSS组相比，L. plantarum/mBD14能够显著提高紧密连接蛋白的表达量（P＜0.05），而其他两种对照菌株未表现出明显的效果。综上，L. plantarum/mBD14预处理能够改善DSS诱导的肠道屏障。

5、L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠的免疫调节作用

利用qPCR检测小鼠结肠内促炎性细胞因子Il1b、Il6、Il12、Il17a和Il18基因表达情况，结果如图5所示，在DSS组小鼠中这些促炎性细胞因子的基因表达水平高度显著升高（P＜0.001）。而L. plantarum/mBD14预处理显著降低了促炎性细胞因子的表达（P＜0.01、P＜0.001）。同时Il17a和Il18在L. plantarum和L. plantarum/0预处理组的表达量也显著下调（P＜0.05、P＜0.01）。而Il18和Il1b的过度表达在IBD发病机制中起重要作用，本实验已在mRNA水平上检测到Il18和Il1b的显著变化。有研究表明在IBD患者和小鼠急性结肠炎中，NLRP3被激活，与接头分子ASC和Caspase-1形成炎症小体复合体，导致Caspase-1的激活，促进pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成活性的IL-1β和IL-18。采用Western blot检测发现DSS组小鼠结肠内剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表达量极显著升高（P＜0.01），而L. plantarum/mBD14预处理使剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表达极显著抑制（P＜0.01），进一步检测其上游通路NLRP3炎症小体的表达情况，结果显示，与DSS组小鼠相比，L. plantarum/mBD14显著抑制了NLRP3及其下游ASC和Caspase-1的蛋白表达（P＜0.01、P＜0.05），而L. plantarum或L. plantarum/0均未产生抑制作用（图5F）。

综上，L. plantarum/mBD14抑制DSS诱导的NLRP3炎症小体及下游炎症通路的激活，减少IL-1β和IL-18的分泌，进而缓解结肠炎症。

结论

本实验构建了具有Usp45分泌序列的重组菌株，即表达mBD14的植物乳植杆菌L. plantarum/mBD14，实现了mBD14在肠道中的靶向递送。用L. plantarum/mBD14对DSS诱导的结肠炎小鼠进行预处理，可明显缓解结肠炎症状。同时，L. plantarum/mBD14能够调节肠道菌群，维持肠道屏障完整性，减少促炎性因子的表达，抑制NLRP3炎症小体及下游炎症通路的激活，进而减轻炎症反应。这一策略可促进益生菌和抗菌肽对于IBD的临床应用。

专家简介

孙嘉教授，博士生导师，江南大学食品学院。国家优秀青年基金获得者，国家海外高层次人才，江苏省杰出青年基金获得者，江苏省双创团队领军人才，江苏省双创计划人才。任Frontiers in Immunology、Frontiers in Nutrition期刊副主编，中国工程院院刊Engineering青年通讯专家，Molecular Nutrition & Food Research编委。

孙嘉教授参与主持重大研究计划（培育项目）等国家自然科学基金项目6 项，江苏省自然科学基金、江苏省“双创计划”等省部级以上科研和人才项目10余项，作为中方负责人主持科技部中新交流计划项目和国家外专局高端外国专家项目。在Immunity（封面文章）、Gastroenterology、EMBO Molecular Medicine（封面文章）、Allergy（2 篇）、British Journal of Pharmacology（3 篇）、Theranostics、BMC Medicine、FASEB Journal（2 篇）、Acta Pharmacologica Sinica（3 篇，封面文章1 篇）、Molecular Nutrition & Food Research等权威期刊发表一作或通信SCI论文。系列研究发现肠道菌群代谢物丁酸可促进胰岛β细胞表达抗菌肽CRAMP、维持胰腺免疫稳态和机体内分泌健康的新作用与机制，为首次明确肠道菌群通过肠-胰轴对胰岛免疫调节的机制；并系统解析丁酸梭菌、结构特异性益生元等促进肠道菌群与胰腺免疫健康的膳食组分。相关工作被Nature、Nature Reviews Immunology、Nature Review Microbiology、Immunity等国际顶级期刊正面引用评价，Faculty 1000选列为推荐文章，国家自然科学基金委针对相关成果做基金要闻报道，国内外主流学术媒体（Science Daily、生物通等）评论为重要科学发现。担任首届抗菌肽主题的高登研究研讨会（Gordon Research Seminar-Antimicrobial Peptides，美国加州）主席工作。

本文《表达鼠源β-防御素14的植物乳植杆菌减轻小鼠急性结肠炎》来源于《食品科学》2022年43卷17期1-11页，作者：陈小培，田海芝，任正楠，潘礼龙，孙嘉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220509-110。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。