小肠是人体消化吸收的重要场所，主要通过酶类物质作用糖类、胆固醇、蛋白质等营养物质，小肠微生物数量远低于大肠，然而有研究表明，小肠菌群的失调在各类疾病的发生发展中有着独特的作用机制：1）小肠菌群失调可能导致小肠绒毛排列不规则并发生不同程度的断裂，使黏膜通透性增加，屏障功能下降；2）小肠上皮细胞中大量表达钠-钾-ATP酶，该酶在菌群失调时含量下降，导致细胞渗透压改变，细胞结构受到破坏，这两种机制可能协同破坏小肠对糖类、蛋白质、脂肪等物质的吸收作用，引发糖尿病等疾病的发生。因此通过改善饮食等途径增加小肠内益生菌数量、控制有害菌繁殖可作为维持小肠稳态、调节体内代谢、预防疾病的重要举措。

如图3A所示，从门水平来看，厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）是各组中的优势菌群，相比NC组，LRS组Firmicutes相对丰度增加，Actinobacteriota相对丰度减小；SL组Firmicutes相对丰度减小；LRS+SL组拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度增加。其中，Firmicutes代谢产物丁酸盐具有抗炎、改善胰岛素抵抗的作用，其相对丰度增加有利于预防肥胖和2型糖尿病的发生发展，Firmicutes利用或分解乳酸的能力较弱，在SL组中相对丰度下降，这与Policastro等研究结果一致。科水平以乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）为主要物种，其次是棒状杆菌科（Corynebacteriaceae）和消化链球菌科（Peptostreptococcaceae），相较于NC组，LRS组乳酸杆菌科、消化链球菌科相对丰度上调，且棒状杆菌科相对丰度下调，SL组和LRS+SL组均表现为消化链球菌科相对丰度下调（图3B）。属水平上，乳酸杆菌属（Lactobacillus）相对丰度最高，棒状杆菌属（Corynebacterium）、Romboutsia次之，LRS组Lactobacillus上调而Corynebacterium相对丰度下调，LRS组Romboutsia相对丰度增加，在其余两组Romboutsia相对丰度降低（图3C）。对图3C中相对丰度前15的物种进行筛选，其中具有显著差异的物种如图3D所示，结合图3E和图3F可知，Dietzia在LRS组中的相对丰度低于其余3 组，漫游球菌属（Vagococcus）在LRS组、SL组和LRS+SL组中的水平均极显著低于NC组（P＜0.01）。LRS+SL组相较其余各组表现出显著促进unclassified_f__Ruminococcaceae生长（P＜0.01）和抑制异杆菌属（Allobaculum）繁殖（P＜0.05）的效果。其中，Lactobacillus被认为是保护肠道屏障、调控免疫应答、抗病原菌感染、调节代谢、预防炎症的益生菌；Dietzia可通过产生天然类胡萝卜素（角黄素）发挥抗氧化、预防癌症的作用；Vagococcus与人类肠道感染疾病有关，类似于肠杆菌属（Enterococcus）和肉食杆菌属（Carnobacterium）等致病菌。

在属水平上，与NC组相比，LRS组Vagococcus（P＜0.01）、Dietzia（P＜0.05）、Enterorhabdus（P＜0.05）、Coriobacteriaceae_UCG-002相对丰度显著或极显著降低，norank_f__Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group相对丰度显著增加（P＜0.05）（图4A）。有研究表明，Enterorhabdus被认为是人体肠道致病菌之一，其参与了肠道内未消化蛋白的发酵，可能破坏肠道稳态，其产物氨、腐胺等与结直肠癌的发生有密切联系；Coriobacteriaceae_UCG-002被证明在病态肥胖个体肠道菌群中相对丰度较高，可能具有潜在的致代谢紊乱作用。SL组Lactococcus相对丰度显著降低（P＜0.05），unclassified_f__Micrococcaceae、unclassified_f__Aerococcaceae相对丰度显著增加（P＜0.05）（图4B）。LRS+SL组Vagococcus、Allobaculum相对丰度极显著降低（P＜0.01），unclassified_f__Ruminococcaceae（P＜0.01）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（P＜0.05）相对丰度极显著或显著增加（图4C）。此外，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae同属Firmicutes，是人类肠道中常见的菌群，能水解淀粉和糖类从而产生丁酸盐及短链脂肪酸。同时，LRS组和SL组相对LRS+SL组均表现出显著较低的unclassified_f__Ruminococcaceae相对丰度（P＜0.05）和极显著较高的Allobaculum相对丰度（P＜0.01）（图4D、E）。Allobaculum的相对丰度与ANGPTL4（即一种脂质代谢的关键调节因子，也是肠道微生物群和脂肪沉积的循环介质）的表达呈正相关，且有实验表明，高脂饮食处理也使小鼠Allobaculum相对丰度显著增加。

由此可见，LRS和SL的饮食干预有利于小肠菌群结构的优化、维持肠道稳态，这与Zeng Hongliang等研究结果具有一致性。另外，LRS和SL协同作用促进了unclassified_f__Ruminococcaceae的增殖并抑制了Allobaculum的增殖，具有预防代谢紊乱的潜在功效。

3、 LRS、SL干预后大鼠肠道代谢谱差异

代谢谱数据的OPLS-DA结果如图5所示。在阴离子模式下，LRS组与NC组、LRS+SL组与NC组、LRS组与LRS+SL组、SL组与LRS+SL组代谢模式均可完全分离，表明LRS及LRS与SL协同作用均可有效干预代谢模式的变化。

在VIP＞1，P＜0.05、FC＜1或FC＞1的条件下，将所筛选出的差异代谢物与KEGG数据库比对分类，结果如图6所示，具体差异代谢物见表1。综上所述，LRS和SL均有利于类固醇激素的合成，且LRS单独作用时可促进大鼠体内(R)-硫辛酸、银杏内酯A、α-姜黄素等物质水平的增加，有利于调节氨基酸和脂质代谢；SL干预可调节类固醇激素及磷脂等代谢物水平；二者共同作用时，对氨基酸代谢和维生素代谢的调节作用更为明显，并可能提高机体对有害代谢物的抵抗作用。

LRS组、SL组、LRS+SL组与NC组间及LRS组、SL组与LRS+SL组之间差异显著的功能通路如图7所示。其中，横轴表示通路中代谢物在通路中的相对重要性，气泡大小代表通路重要性值。NC组与LRS组有2 条差异较大的功能通路：类固醇激素（steroid hormone）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）通路（图7A）。类固醇激素功能通路与雌激素、皮质甾酮、脱氢表雄酮等类固醇及其衍生物有关，并与一种调节胆汁酸代谢及脂质代谢的细菌Oscillibacter丰度呈正相关。NC与SL组有4 条差异较明显的功能通路：类固醇降解（steroid degradation）、类固醇激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、初级胆汁酸合成（primary bile acid synthesis）、谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）通路（图7B）。其中，初级胆汁酸合成对抗胆汁淤积有重要作用。谷胱甘肽代谢是机体内重要的抗氧化和代谢调节的途径，能够清除氮氧自由基、预防肝脏疾病。对照组与LRS+SL组有3 条差异较明显的功能通路：氨酰tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）、β-丙氨酸代谢（β-alanine metabolism）、星孢菌素生物合成（staurosporine biosynthesis）通路（图7C）。LRS组与LRS+SL组间有2 条差异较大的功能通路：谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）、抗坏血酸和醛酸代谢（ascorbate and aldarate metabolism）（图7D）。SL组与LRS+SL组间有3 条差异较大的功能通路：黄酮和黄酮醇（flavone and flavonol）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）和甘油磷脂代谢（glycerophospholipid metabolism）通路（图7E）。β-丙氨酸代谢等氨基酸代谢通路及甘油磷脂代谢等脂质代谢通路均与预防代谢综合征等疾病有关。综上，LRS及SL单独作用时均表现出氨基酸代谢和激素代谢调节的重要作用，SL还在优化肝功能、增强肝防御系统方面有促进作用；二者协同作用时有利于维持脂质代谢、维生素代谢稳定并促进生物活性物质的合成和表达。

4、菌群多样性与代谢谱相关性分析结果

对小肠菌群差异菌属与差异代谢物进行相关性分析，所得结果如图8所示，球链菌属（Globicatella）、罗斯氏菌属（Rothia）、红球菌（Rhodococcus）、Bacillaceae、Gemella、不动杆菌（Acinetobacter）、Ralstonia与LysoPC(24:1(15Z))（P＜0.05）、去氢催吐萝鞭木醇（P＜0.001）、辣椒素、油酰乙醇酰胺、皮质甾酮、雌激素、(R)-硫辛酸、雌三醇、银杏内酯A（P＜0.05）呈显著正相关，与L-丝氨酸、降胭脂木酯、LysoPC(20:2(11Z,14Z))、LysoPC(18:1(9Z))呈显著负相关（P＜0.05）。Lachnospiraceae_UCG-001与LysoPC(24:1(15Z))（P＜0.05）、去氢催吐萝鞭木醇（P＜0.001）、辣椒素（P＜0.05）、油酰乙醇酰胺（P＜0.01）、皮质甾酮（P＜0.01）呈显著正相关。Enterorhabdus与雌激素、(R)-硫辛酸、银杏内酯A呈显著负相关（P＜0.01）。Allobaculum与瓜氨酸呈显著负相关（P＜0.01），与LysoPC(17:0)、组氨酸等维生素呈显著正相关（P＜0.05）。

结 论