食品界

东南大学王少康教授等：连翘苷对食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞的抑制作用及机制

据统计，我国食管癌的发病率和死亡率居高不下，是威胁国民健康的高发性恶性肿瘤。目前食管癌治疗有手术切除、化疗和放疗，但副作用不容忽视。中药在我国应用历史悠久，资源丰富，具有成本低廉、毒副作用较小等特点，因而在中药中筛选抗癌生物活性成分并探讨其抗癌机制显得尤为重要。

越来越多的研究显示连翘苷可通过多种信号通路如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）（也称为PI3K/AKT）、Janus激酶/信号转导与转录激活子（JAK/STAT）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）等信号通路发挥作用。东南大学公共卫生学院的郭子琪、王少康*等以食管上皮恶性转变细胞（本课题组自制）和Eca-109细胞为研究对象，观察连翘苷对这两种细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响，并从PI3K/AKT信号通路探讨其作用机制，为新食品原料连翘叶的进一步开发利用提供科学依据。

1、食管上皮恶性转变细胞的确定

如图1所示，HEEC和食管上皮恶性转变细胞的克隆形成率分别为（0.60±0.08）%、（4.23±0.21）%，与HEEC相比，食管上皮恶性转变细胞的克隆形成率显著升高（P＜0.05），说明食管上皮恶性转变细胞的细胞增殖能力较强。研究表明食管鳞癌的癌前病变主要指食管鳞状上皮细胞的异型增生，因此认为食管上皮恶性转变细胞具有一定的致瘤能力，属于食管癌前病变细胞。

2、连翘苷对食管上皮恶性转变细胞、Eca-109细胞和HEEC存活率的影响

CCK8法检测结果（表1）显示，10、100、200、400、600、800 μmol/L和1 000 μmol/L连翘苷均可抑制食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞增殖，其IC50值分别为308.4 μmol/L和322.0 μmol/L；然而，1、10、100 μmol/L连翘苷可促进HEEC增殖，200、400、600、800 μmol/L和1 000 μmol/L连翘苷可抑制HEEC增殖，其IC50值为384.4 μmol/L。结合连翘苷对3 种细胞增殖的影响，1、10、100 μmol/L连翘苷对HEEC增殖无明显的抑制，这证明了连翘苷浓度在低于或等于100 μmol/L时对HEEC无明显的细胞毒性作用；而10、100 μmol/L连翘苷可抑制食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞增殖，且为避免高浓度连翘苷细胞毒性的影响，故选择浓度10、100 μmol/L进行后续实验。

3、连翘苷对食管上皮恶性转变细胞的抑制作用及机制

连翘苷对食管上皮恶性转变细胞周期的影响

流式细胞术检测细胞周期结果（图2）显示，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞周期发生显著改变，干预组G0/G1期细胞比例显著增加（P＜0.05），S期细胞比例显著降低（P＜0.05），且随着连翘苷浓度升高，各周期细胞比例变化越明显，说明连翘苷可能通过将细胞阻滞在G0/G1期抑制食管上皮恶性转变细胞增殖。

连翘苷对食管上皮恶性转变细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的凋亡率分别为（8.15±0.14）%、（10.76±0.46）%和（22.83±0.13）%（图3）。与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）。说明连翘苷可能通过促进细胞凋亡抑制食管上皮恶性转变细胞增殖。

连翘苷对食管上皮恶性转变细胞迁移、侵袭的影响

如图4A、B所示，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的迁移穿膜细胞数分别为295.20±14.62、190.20±20.30和136.60±7.94。与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的迁移穿膜细胞数显著减少（P＜0.05），说明经10、100 μmol/L连翘苷干预后的食管上皮恶性转变细胞迁移能力降低。由图4C、D可知，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的侵袭穿膜细胞数分别为169.80±16.81、67.60±4.63和47.60±1.50。与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞的侵袭穿膜细胞数显著减少（P＜0.05），说明经10、100 μmol/L连翘苷干预后的食管上皮恶性转变细胞侵袭能力降低。

连翘苷对食管上皮恶性转变细胞中蛋白表达的影响

Western blotting检测结果如图5显示，在PI3K/AKT通路蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。在周期相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞中p21蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。在凋亡相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。在侵袭迁移相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的食管上皮恶性转变细胞中MMP9蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

4、连翘苷对Eca-109细胞的抑制作用及机制

连翘苷对Eca-109细胞周期的影响

流式细胞术检测细胞周期结果如图6所示，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞周期发生明显改变，干预组G0/G1期细胞比例显著增加（P＜0.05），S期细胞比例明显降低（P＜0.05），且随着连翘苷浓度升高，各周期细胞比例变化越明显，说明连翘苷可能通过将细胞阻滞在G0/G1期抑制Eca-109细胞增殖。

连翘苷对Eca-109细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡结果如图7所示，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞的凋亡率分别为（9.92±0.59）%、（12.71±0.50）%和（15.42±0.01）%。与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组Eca-109细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05），说明连翘苷可能通过促进细胞凋亡抑制Eca-109细胞增殖。

连翘苷对Eca-109细胞迁移、侵袭的影响

Transwell迁移实验结果如图8A、B所示，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞的迁移穿膜细胞数分别为413.60±12.02、310.04±9.91和183.60±10.30。与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组Eca-109细胞的迁移穿膜细胞数显著减少（P＜0.05），说明经10、100 μmol/L连翘苷干预后的Eca-109细胞迁移能力降低。Transwell侵袭实验结果（图8C、D）显示，0、10、100 μmol/L连翘苷干预组Eca-109细胞的侵袭穿膜细胞数分别为44.40±3.82、20.00±2.00和7.40±0.48，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组Eca-109细胞的侵袭穿膜细胞数显著减少（P＜0.05），说明经10、100 μmol/L连翘苷干预后的Eca-109细胞侵袭能力降低。

连翘苷对Eca-109细胞中蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，在PI3K/AKT通路蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）（图9）。在周期相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞中p21蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。在凋亡相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。在侵袭、迁移相关蛋白表达方面，与0 μmol/L干预组相比，10、100 μmol/L连翘苷干预组的Eca-109细胞中MMP9蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

结论

综上，连翘苷可抑制食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞的增殖、迁移、侵袭发生，且随着浓度的增加抑制作用越显著，其机制与抑制PI3K/AKT通路中相关蛋白的表达有关。

通信作者简介

王少康，男，1975年出生，中共党员，注册营养师，博士/教授，东南大学公共卫生学院营养与食品卫生系主任，博士生导师，主要研究方向为营养与肿瘤、食品毒理与食品功效。曾主持国家自然基金3项，国家科技支撑计划项目子课题1项，中国营养学会营养科研基金-飞鹤体质营养与健康研究基金项目1项，江苏省预防医学基金项目1项，镇江市社会发展指导性科技计划项目1项，中央高校基本科研业务费专项资金项目1项，东南大学儿童发展与学习科学教育部重点实验室开放基金1项，参与国家级及省部级项目36项；主持东南大学校级教改项目5项，参与省级教改项目1项。现为中国营养学会理事、中国营养学会基础营养分会委员、中国老年学和老年医学学会营养食品分会委员、江苏省营养学会常务理事、江苏省营养学会青年营养科技传播专家团副团长、江苏省营养学会公共营养专业委员会委员、南京营养学会副秘书长、江苏省实验动物协会理事。担任学术期刊《Nutrition & Metabolism》、《食品科学》、《东南大学学报（医学版）》、《现代医学》等杂志的论文审稿人；教育部学位与研究生教育发展中心评审专家、国家自然科学基金项目评审专家。

第一作者简介

郭子琪，女，1997年生，共青团员，东南大学公共卫生学院营养与食品卫生系硕士研究生，主要研究方向为营养与肿瘤，研究课题为基于PI3K/AKT信号通路探讨连翘苷抑制HEEMTC和Eca-109细胞的作用及其机制研究。本人在校期间学习认真，完成了全部专业课程的学习，学习成绩优秀，具备完善的知识结构和理论水平，多次参加学术会议，发表了一篇CSCD综述，申请了一项专利，荣获“校三好研究生”称号。曾参加达能营养中心膳食营养研究与宣教基金项目《维生素B12与食管鳞癌癌前病变关系及机制研究》，实验动手能力强，可熟练进行PCR、western blot等实验操作，熟练使用Flow Jo、Image J等软件。曾参与功能性膳食纤维证据体评价和互联网+合理膳食营养科普项目的撰写。曾在第十一届亚太临床营养大会暨中国营养学会第十四届全国营养科学大会做志愿者，曾参加东南大学2020年迎新志愿服务活动。

本文《连翘苷对食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞的抑制作用及机制》来源于《食品科学》2022年43卷15期176-184页，作者：郭子琪，王少康，桂兰兰，夏惠，孙桂菊。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220104-021。