FSHW | 粪便代谢组学揭示了蜂胶乙醇提取物对T2DM小鼠具有积极作用

Introduction

2型糖尿病（T2DM）是以胰岛素作用进行性下降（胰岛素抵抗[IR]）并伴随β细胞无法补偿IR（胰岛β细胞功能障碍）为特征的一种异质性疾病。国际糖尿病联盟（IDF）发布的最新糖尿病地图集显示，2019年，全球共有4.63亿20至79岁的成年人患有糖尿病（每11人中就有1人患有糖尿病），预计到2045年病例将达到7.02亿。越来越多的证据表明，肝脏疾病和肠道菌群可能与肥胖、IR和T2DM等代谢性疾病的发生密切相关。研究表明，除了中性脂质（如甘油三酯（TG）或胆固醇脂质）外，其他脂质，包括二酰基甘油（DAG）、神经酰胺、脂肪酸及其代谢产物都具有潜在的生物活性，并可能在肝脏中达到过高的水平。因此，它们的积累可能会干扰肝细胞的功能，特别是肝细胞对胰岛素水平变化的反应能力。此外，研究发现，微生物靶标可能具有降低IR和常见疾病及心血管疾病的发病率。由于T2DM的发病机制复杂多样，目前尚未完全阐明。各种干预措施已被用于延缓T2DM的进程。临床用药如二甲双胍、磺胺类药物和新药噻唑烷二酮类药物（TZD）有治疗作用，但也对身体有一些不良副作用。大多数药物只用于单通道治疗，而不是多靶点治疗。因此，越来越需要开发更有效的、副作用更小的抗糖尿病药物。

作为一种天然产物，目前已从蜂胶中分离鉴定出300多种化学成分，包括多酚类、萜烯类、醌类、酯类、醛类、酮类和烃类，因此被称为“天然紫金”。在中国，蜂胶的主要成分是多酚类物质，其中酚酸类和黄酮类是主要的功能成分。研究表明，蜂胶中的黄酮类化合物（如白杨素、山奈酚、槲皮素和柚皮素）和酚酸（如咖啡酸、肉桂酸、绿原酸、咖啡酸苯乙酯和阿特匹林C）由于具有抗菌、抗炎和免疫调节功能，对糖尿病有一定的疗效。最近的一项研究表明，蜂胶不仅能降低糖尿病大鼠的血糖，还能修复肠道黏膜损伤，有利于肠道菌群，改善糖尿病大鼠的短链脂肪酸（SCFAs）水平。

代谢组学是一门研究内源性小分子代谢物（分子量（mw）＜1000 kDa）在疾病侵袭、药物干预、环境变化等内外因素影响下的种类、数量变化及相互关系的学科。目前，它已被广泛应用于疾病机制的研究、生物标志物的发现、临床疗效的评价和预测等领域。本研究的目的是基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱（UPLC-Q-TOF-MS）代谢组学策略，确定T2DM和正常小鼠的粪便代谢谱，以筛选T2DM的潜在生物标志物，探讨蜂胶乙醇提取物（EEP）对T2DM发病机制的影响。总之，本研究旨在进一步阐明T2DM的发病机制，并为EEP的临床应用提供新思路。

Results and Discussion

EEP对体质量、血糖和血清胰岛素的影响

EEP对体质量、血糖和血清胰岛素的影响如图1所示，EEP干预后，EEP可减缓T2DM小鼠体质量下降，呈剂量依赖性，并显著降低了血糖水平（图1A，B），这一结果可能与EEP中的有效化合物咖啡酸苯乙酯有关，但其确切机制还需要开展进一步研究。此外，EEP改善了胰岛素敏感性，增加体内胰岛素含量，降低了HOMA-IR水平，进而调控了机体中的血糖稳态（图1C，D）。

图1 EEP对小鼠（A）体质量、（B）血糖、（C）胰岛素及（D）胰岛素抵抗的影响

EEP对血液生化指标的影响

在图2中发现，EEP干预后，可以改善脂质代谢紊乱，这可能与蜂胶中富含酚类物质有关。此外，对蜂胶活性成分的研究表明，蜂胶中大量的黄酮类和酚类物质可以直接清除自由基，增强机体的抗氧化能力，从而改善肝脏损伤。本研究结果表明两种剂量的EEP干预均对肝功能具有不同程度的恢复作用（图2E，F），这一结果可能与其抗氧化活性有关。

图2 EEP对小鼠（A）TC、（B）TG、（C）HDL-C、（D）LDL-C、（E）AST和（F）ALT的影响

EEP对T2DM小鼠肝损伤的影响

肝脏组织的组织病理学描述见图3A-3D。与T2DM组中的肝组织相比，EEP干预后的肝小叶结构更清晰，只有部分肝细胞有轻度颗粒状变性（黑色箭头）并且未见明显炎症细胞浸润。T2DM患者的胰岛素抵抗促进脂肪组织释放游离脂肪酸（FFA），增加肝脏中的FFA，并促进线粒体氧化应激。过多的活性氧（ROS）诱发肝细胞的炎症和坏死，激活肝脏产生更多的胶原蛋白和结缔组织。组织生长因子积累细胞外基质，然后发展为肝纤维化，并进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。本研究结果表明，EEP对T2DM引起的肝组织损伤有良好的恢复作用，从而减少了慢性肝病及其并发症的发生。

（A）Con组，（B）T2DM组，（C）EEP-L组，（D）EEP-H组。HE染色；×400

图3 EEP对T2DM小鼠肝损伤的影响

代谢图谱分析

采用基于UPLC-Q-TOF-MS的代谢组学方法分析四组小鼠粪便中代谢物的变化，并结合PCA和OPLS-DA进行多变量统计分析，筛选潜在的生物标志物。PCA得分图（图4A～C）显示出了各组之间的总体差异。为了更好地区分组间代谢物，建立了OPLS-DA模型，使数据之间的协方差最大化。如图5A，C，E所示，与T2DM组相比，EEP干预组（EEP-L组和EEP-H组）之间有明显的分离，尤其是T2DM组与EEP-H组之间的差异很大，这一结果表明蜂胶对T2DM的粪便代谢物有很大影响。

（A）Con vs. T2DM；（B）T2DM vs. EEP-L；（C）T2DM vs. EEP-H

图4 四组小鼠粪便代谢谱PCA评分图比较

OPLS-DA：（A）T2DM vs. EEP-L；（B）T2DM vs. EEP-L；（C）T2DM vs. EEP-H；置换检验图：（D）Con vs. T2DM；（E）T2DM vs. EEP-L；T2DM vs. EEP-H

图5 四组小鼠粪便代谢谱的OPLS-DA评分图和置换检验图的比较

LC-MS代谢谱分析及相关路径分析

根据OPLS-DA模型得到变量权重值（VIP），以VIP＞1、P＜0.05为标准筛选潜在的生物标志物。筛选出了27个潜在的生物标志物，如表1和图6所示，这些代谢物主要参与甾醇脂类、脂肪酸、甘油磷脂、聚酮类、前醇脂类、甘油脂类和鞘脂类的代谢途径。EEP干预后，与T2DM组相比，EEP-L组有6种代谢物明显下调，12种代谢物明显上调，9种代谢物无明显变化；EEP-H组有8种代谢物明显下调，19种代谢物明显增加。EEP可能通过改变炎症、氧化应激、氨基酸和脂质的代谢途径，有效调节T2DM引起的甘油脂、鞘脂、核黄素和类固醇代谢途径破坏（见正文）。

表1 潜在生物标志物的鉴定结果

图6 粪便样品中27种代谢物的相对含量

Conclusion

蜂胶是一种天然药物，具有广泛的生物活性和药理作用，在治疗T2DM方面已经显示出疗效。本研究采用血清生化、肝脏形态学、粪便代谢组学等方法，结合STZ诱导的T2DM小鼠模型检测EEP对HFD的治疗作用及代谢调控。结果阐明了EEP治疗T2DM的潜在作用机制，为T2DM的治疗提供了一个新的方向。然而，该研究也有一些局限性。仅从整体代谢组学的角度研究了蜂胶对T2DM的影响；还没有确定蜂胶中影响T2DM的具体活性成分。在此研究基础上，本研究组将通过分析EEP的化学成分，确定EEP中影响T2DM的活性成分。在T2DM小鼠中发现的差异性代谢物需要用人类患者的样本进行验证。

第一作者

王春梅，女，中共预备党员，云南省昭通人，2018年-2021年在山西农业大学动物科学学院畜牧学专业攻读硕士学位，主要研究方向为蜂产品生物学功能。参与山西省高等教育振兴计划“1331工程”项目。在国内期刊《食品工程》发表论文一篇。

通信作者

姜玉锁，男，中共党员，1963年10月生，博士，二级教授，博士生导师，山西省万荣县人。现任动物生产研究所所长、教授委员会委员。兼任中国养蜂学会常务理事、蜜蜂生物学专业委员会副主任；山西省蜂业协会会长。曾两度赴日进修访问。主持并完成国家自然科学基金2项，省部级科研项目9项，获山西省科技进步奖二等奖1项，鉴定成果奖1项。在《Journal of Insect Science》、《Applied Entomology and Zoology》、《中国农业科学》、《昆虫学报》、《动物学报》等国内外学术刊物发表论文80余篇，其中SCI收录20余篇。出版蜂学教材及著作11部，其中主编3部、副主编5部；中国农业百科全书《蜂业卷》编委、《蜜蜂生物学》分支副主编。已培养出博士研究生8名，硕士研究生11名，目前有在读博士4名、硕士11名。曾获“山西省高校青年教师教学基本功竞赛”二等奖、山西农业大学“三育人”先进个人和山西农业大学“优秀教师”等荣誉称号。2019、2020年度国家自然科学基金委生命科学部学科评审组会议评审专家。

Fecal metabolomics reveals the positive effect of ethanol extract of propolis on T2DM mice

Chunmei Wang^a, Huiting Zhao^b, Kai Xu^c, Yali Du^d, Jinjia Liu^a, Jinfei Wang^a, Yusuo Jiang^a

^a College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China

^b College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China

^c Jilin Province Institute of Apicultural Science, Jilin 132108, China

^d College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China

*Corresponding author.

Abstract

A large number of studies have shown that propolis has positive effects in the treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM). However, there are have only been a few reports that are based on an ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) analysis of the fecal metabolomics of ethanol extract of propolis (EEP) in the treatment of T2DM. The present investigation was designed to screen potential biomarkers of T2DM by the metabonomic method and to explain the possible anti-diabetes mechanism of EEP according to the changes in the biomarkers. The results showed that EEP improved the body weight (BW) of T2DM mice, lowered blood sugar levels, and significantly restored blood biochemical indicators related to T2DM, such as fasting insulin (FINS), homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR), aspartate transaminase (AST), and alanine aminotransferase (ALT). Liver pathology showed that EEP reversed liver damage caused by T2DM. Metabolomics data identified 27 potential biomarkers in fecal samples. EEP effectively regulated the dysfunction in the metabolic pathways of glycerophospholipids, sphingolipids, riboflavins, and sterol lipids caused by T2DM. In summary, our research results revealed positive effects of EEP in the treatment of T2DM and provided potential candidate markers for further research and in the clinical treatment of T2DM.

Reference:

WANG C M, ZHAO H T, XU K, et al. Fecal metabolomics reveals the positive effect of ethanol extract of propolis on T2DM mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(1): 161-172. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.034.

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