乳清蛋白约占牛乳总蛋白含量的20%，其通常由球状蛋白组成，如α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白（Ig）等。其中，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的含量最高，分别占乳清蛋白含量的52%和19%。乳清蛋白具有极高的营养价值，研究表明，乳清蛋白可改善人们的睡眠质量，促进婴幼儿胃肠道功能的发育，增强抵抗力。然而，乳清中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是牛乳中主要过敏原。

如图2所示，WPC的主要蛋白质是分子质量为14.2 kDa的α-乳白蛋白和18.4 kDa的β-乳球蛋白。泳道2（臭氧处理5 s）和泳道3（臭氧处理10 s）中，乳清蛋白主要成分未发生明显变化，但分子质量为34 kDa左右的蛋白条带颜色变深，这可能是由于臭氧的氧化作用，使相邻的β-乳球蛋白单体中游离半胱氨酸之间形成二硫键，产生了更多的β-乳球蛋白二聚体，且β-乳球蛋白的游离半胱氨酸位于蛋白分子结构的中心，其形成的二硫键不易被β-巯基乙醇还原。随着臭氧处理时间进一步延长，与未处理样品相比，臭氧处理后的乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白单体的浓度降低，高分子质量条带更为明显，说明臭氧处理使乳清蛋白单体之间形成了不同程度的聚合物。

由表2可知，臭氧处理组的丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸的相对含量较未臭氧处理的样品均降低，其中甘氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和组氨酸的变化大致随着臭氧处理时间的延长显著递减，其他氨基酸组分相对含量则没有明显降低。

如图3所示，在5、10、15、20 s和25 s的臭氧处理条件下，未处理样品和臭氧处理样品游离巯基含量分别为5.78、4.49、3.85、3.01、2.92 µmol/g和2.13 µmol/g，总巯基含量分别为14.98、14.73、14.12、13.80、13.60 µmol/g和12.97 µmol/g，而二硫键含量分别为4.60、5.12、5.13、5.39、5.34 µmol/g和5.42 µmol/g。与未处理样品相比，臭氧处理样品无论是游离态巯基还是总巯基含量均略有下降，而二硫键含量略微升高。巯基含量的减少主要原因可能是含硫氨基酸的氧化生成了不同的残基，如对氧化剂敏感的半胱氨酸，氧自由基作用位点非常浅，氧化可能会形成亚磺酸/磺酸，而甲硫氨酸被氧化为甲硫氨酸砜。而二硫键含量的升高则是因为两分子半胱氨酸侧链上的巯基聚集形成新的二硫键。

如图4和表3所示，与未处理的乳清蛋白相比，臭氧处理会使乳清蛋白中各二级结构之间相互转化。随着时间的延长，α-螺旋相对含量降低，β-折叠相对含量稍有增加，β-转角相对含量总体变化较小，无规卷曲相对含量则呈先增加后降低的趋势。这可能是因为短时的臭氧处理导致乳清蛋白去折叠，蛋白结构部分展开，从而使其严谨有序的二级结构趋于松散，天然球状形态丢失，使其更具弹性。随着处理时间的延长，蛋白分子聚集，二硫键含量增加，而二硫键的存在有助于加强和稳定蛋白质结构，使分子结构更为有序。

从图5可看出，WPC的紫外光谱图在280 nm附近有特征吸收峰，这主要是由蛋白肽链上色氨酸和酪氨酸残基的芳香杂环π→π*跃迁引起。当臭氧处理时间为5 s时，样品的特征吸收峰未发生偏移，但强度更高，说明短时间的臭氧处理不会改变色氨酸和酪氨酸残基的侧链基团分布，但会使乳清蛋白的空间结构展开，更多的色氨酸和酪氨酸残基暴露，三级结构变得松散。随着臭氧处理时间的延长，乳清蛋白的紫外最大吸收峰强度逐渐增加，且出现较为明显的蓝移，这说明较长时间的臭氧处理会使蛋白质的空间结构及氨基酸侧链基团发生明显变化，从而导致具有紫外吸收能力的氨基酸的微环境发生改变。

如图6所示，当臭氧处理时间为5 s时，乳清蛋白的内源荧光变化不明显，但随着处理时间的延长，乳清蛋白内源荧光逐渐降低，当处理时间为25 s时，其特征峰值仅为未处理样品的6.94%，且发生了9 nm的蓝移。这可能是由于色氨酸具有低单电子氧化势能，极易转化为不稳定的色氨酸自由基，进而被臭氧氧化为犬尿氨酸，使内源荧光强度下降。而随着反应的进行，蛋白质的聚集使蛋白分子内未被氧化的色氨酸重新回到非极性环境中，使其最大吸收波长发生蓝移。

从图7和表4可知，臭氧处理使得峰a和峰b的峰强发生明显下降。综合分析可知，臭氧处理使乳清蛋白中部分酪氨酸和色氨酸残基转化为其衍生物，导致荧光猝灭，同时蛋白分子的聚集使色氨酸等疏水性氨基酸暴露减少，蛋白质的三级结构发生改变。

如图8所示。在较短时间（5、10 s）的臭氧处理条件下，乳清蛋白的表面疏水性呈递增趋势，但随着处理时间的延长（15～25 s），样品的表面疏水性发生明显降低，并与处理时间呈显著负相关。这种变化可以通过氧化过程中蛋白质构象的改变解释。当臭氧处理时间较短时，臭氧使得乳清蛋白的空间结构发生变化，其结构变得更为松散，天然状态下埋藏在蛋白质内部的疏水性氨基酸暴露于蛋白质表面，使其表面疏水性增强。但随着臭氧时间的延长，越来越多的蛋白质单体之间发生共价或非共价结合，产生了不同程度的多聚体，其表面的疏水基团被掩埋于多聚体内部，导致蛋白质表面疏水性的显著下降。除此之外，臭氧的氧化作用导致甲硫氨酸等疏水性氨基酸含量的变化也是蛋白质表面疏水性改变的关键因素。