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中国农业科学院彭文君研究员等：高效液相色谱-示差折光检测法检测无刺蜂蜂蜜中海藻酮糖含量

2022-11-14作者：来源：食品科学杂志责任编辑：食品界字体A+AA-

海藻酮糖是一种还原性二糖，目前仅在天然无刺蜂蜂蜜中发现，难以用化学合成，研究表明目前只有某些微生物可以通过蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖。这些蔗糖异构体比蔗糖具有更高的酸稳定性，在某种程度上可以增加物种的竞争优势。高蔗糖饮食除了会引起人体的肥胖、高血压、高血脂、高血糖等代谢疾病，还会引起全身和脑部炎症，以及增加结肠直肠癌等风险。

无刺蜂蜂蜜含有多种功效成分，消费者对无刺蜂蜂蜜衍生产品的需求迅速增长，无刺蜂蜂蜜的鉴别、质量控制和标准对于无刺蜂蜂蜜的应用具有重要的支撑意义。但我国无刺蜂蜂产品相关研究刚起步，对其化学组分及营养成分的研究才刚刚开始。中国农业科学院蜜蜂研究所的郑星、王凯*、彭文君*等以我国无刺蜂蜂蜜为研究对象，通过建立无刺蜂蜂蜜中海藻酮糖的检测方法，对我国无刺蜂蜂蜜样品中的海藻酮糖进行分析。通过样品的采集地点、时间、蜂种差异，分析海藻酮糖在无刺蜂蜂蜜中的含量及稳定性，旨在为相关食品标准的建立提供一定参考依据。

1、糖标准品和蜂蜜样品色谱检测

如图1A所示，6 个单标准品溶液的色谱图表明，海藻糖同蔗糖出峰时间完全一致，但其同海藻酮糖可实现明显分离。图1B无刺蜂蜂蜜样品溶液色谱图中3 个主要高响应峰分别为葡萄糖（1号峰，保留时间16.59 min）、海藻酮糖（2号峰，保留时间18.61 min）和果糖（3号峰，保留时间23.02 min）。以洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜、麦卢卡蜜作为常见蜂蜜对照，从图1B可以看出，无刺蜂蜂蜜的葡萄糖和果糖含量低于普通蜂蜜，但含有较高的海藻酮糖。由于海藻酮糖具有丰富的功能和生物利用度，检测出无刺蜂蜂蜜中海藻酮糖的含量有极大的研究价值。

2、高效液相色谱-电喷雾离子源四极杆飞行时间串联质谱分析海藻酮糖

由图2可以看出，从无刺蜂蜂蜜中分离制备的单体物质与海藻酮糖标准品的二级谱图一致，母离子（[M－H]^－）m/z 341.108 9的主要二级碎片为m/z 113、119、179和221。蔗糖在母离子（[M－H]^－）m/z 341.108 9的主要二级碎片为m/z 113、119和179，没有海藻酮糖中的221。麦芽糖在母离子（[M－H]^－）m/z 341.108 9的主要二级碎片为m/z 113、119、161和221，与海藻酮糖的二级离子也有显著差异。这与Fletcher等用UPLC-MS/MS分析的结果一致，海藻酮糖与蔗糖、麦芽糖在母离子（[M－H]^－）m/z 341.108 9的主要二级碎片具有明显的差异性，3 种糖互为同分异构体。因此，通过高效液相色谱-电喷雾离子源四极杆飞行时间串联质谱可进一步确定保留时间18.61 min的目标化合物为海藻酮糖。

3、方法学验证

方法的选择性

从图3可以看出，海藻酮糖与另外5 种糖完全分离，且保留时间与海藻酮糖单体一致。用1.3.2节色谱条件可以将海藻酮糖完整分离出来，方法具有很好的选择性，因此这种色谱条件可以作为检测蜂蜜中海藻酮糖含量的方法。

海藻酮糖标准曲线

由0.5、1、2.5、5、10、25、50 mg/mL的海藻酮糖标准溶液在1.3.2节色谱条件下检测得出的标准曲线，线性方程为Y=1.56×10⁵X＋2.21×10²，R²=0.999 6，因此海藻酮糖在0.5～50 mg/mL范围内线性关系良好。该方法测定海藻酮糖的其LOD为0.07 mg/mL，LOQ为0.22 mg/mL。

重复性、精密度、稳定性实验结果

由表2可以看出，6 份50 mg/mL的海藻酮糖标准品溶液进样后，出峰面积的RSD为2.46%，表明此提取方法重复性良好；同一份海藻酮糖标准品进样后，出峰面积的RSD为0.18%，表明色谱方法的精密度良好；不同时间测定3 份相同质量浓度的海藻酮糖标准品后，出峰面积的RSD为2.43%，表明此色谱方法在5 d内稳定性良好。

回收率实验结果

表3表明，不同添加量海藻酮糖在果葡糖浆中的加标回收率在93.50%～95.71%之间，RSD均不高于0.61%，说明本方法有较好的回收率，结果准确可靠。

4、无刺蜂蜂蜜样品中海藻酮糖含量测定

由表4可知，1～6号样品为2020年5月在云南采集的黄纹无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数为22.90%～30.82%；7～10号样品为2020年5月在云南采集的顶无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数为17.30%～27.91%；11～13号样品为2020年5月和11月在云南采集的戈氏无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数为19.72%～27.74%；14号样品为2020年11月在云南同一蜂场采集的黄纹无刺蜂、顶无刺蜂、戈氏无刺蜂的混合蜂蜜，海藻酮糖质量分数为24.03%；15和16号样品分别为2020年和2019年11月在海南同一蜂场采集的黄纹无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数相似，分别为18.16%和18.52%；17～21号样品为2019年在马来西亚采集的Heterotrigona itama无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数为10.36%～20.92%；22～31号样品为2021年1月在云南采集的黄纹无刺蜂蜂蜜，海藻酮糖质量分数为6.97%～20.61%。

结论

采用高效液相色谱-示差检测器法测定蜂蜜中海藻酮糖的含量，用纯水溶解蜂蜜样品，使用离子配体交换柱Hi-Plex Pb（300 mm×7.7 mm，8 μm）作为分离色谱柱，以纯水作流动相，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温50 ℃，示差检测池温度50 ℃，海藻酮糖质量浓度在0.5～50 mg/mL范围内线性良好，R²为0.999 6。通过高效液相色谱-电喷雾离子源四极杆飞行时间串联质谱检测可知，无刺蜂样品中保留时间为18.61 min的目标化合物是海藻酮糖。方法学检验证实海藻酮糖与其他糖类基线分离，本检测方法的回收率高、重复性好，其LOD为0.07 mg/mL，LOQ为0.22 mg/mL，加标回收率为93.50%～95.71%（RSD≤0.61%）。该方法简单快捷、定量准确，可以实现无刺蜂蜂蜜样品中海藻酮糖的准确定量分析，为我国无刺蜂蜂蜜品质评价提供了科学依据，同时本研究建立的检测方法也可为相关食品标准的开发提供参考。

01通信作者简介

彭文君，男，1970年生，二级研究员，博士，博士研究生导师。中国农业科学院农科英才C类领军人才，中国农业科学院蜜蜂研究所所长、资源昆虫产品加工与功能评价团队创新团队首席科学家，国家蜂产业技术体系岗位专家，主要从事蜂产品加工工艺及装备、蜂产品活性成分提取与鉴定、蜂产品营养功能评价的研究。近年来，获国家技术发明二等奖1项，省部级奖6项、院奖4项，在Nature Communications, Journal of Agricultural and Food Chemistry等学术期刊发表论文100余篇，出版学术著作10余部，培养博硕士研究生10余人。

王凯，男，1988年生，博士，副研究员，硕士生导师。2016年7月至今就职于中国农业科学院蜜蜂研究所，现为中国农业科学院蜜蜂研究所蜂产品质量与风险评估创新团队科研骨干，主要研究方向为蜜蜂及蜂产品学。先后主持国家自然科学基金面上项目、青年基金、中国农科院青年创新专项、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项等课题。近五年在国内外重要刊物上发表论文60余篇，其中以第一/通讯作者发表SCI论文20篇（单篇最高影响因子14.224），ESI高被引论文1篇，H指数30。兼任Frontiers in Nutrition (2021 IF=6.59，JCR Q1), BMC Complementary Medicine and Therapies(2021 IF= 2.838)副主编、Oxidative Medicine and Cellular Longevity (2021 IF= 7.31) 编委。

02第一作者简介

郑星，女，1996年生，2019年9月至今为中国农业科学院蜜蜂研究所博士生。主要从事蜂产品生物活性成分提取与鉴定、蜂产品营养功能与评价的研究。在中国农业科学院就读期间荣获一等优秀学生奖学金、优秀学生干部、优秀学生党员和硕士研究生中期考核优秀奖。分别在期刊《Nutrients》、《食品科学》、《食品工业科技》中各发表1篇文章，在期刊《中国蜂业》中发表两篇文章。

本文《高效液相色谱-示差折光检测法检测无刺蜂蜂蜜中海藻酮糖含量》来源于《食品科学》2022年43卷16期217-225页，作者：郑星，王凯，薛晓锋，汪正威，潘鹏，吴黎明，赵亚周，彭文君。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210520-251。点击https://www.spkx.net.cn/article/2022/1002-6630/2022-43-16-028.html即可查看文章相关信息。