FSHW | 鸡蛋蛋白黄嘌呤氧化酶抑制肽的鉴定:虚拟水解、分子对接及体外活性评价

Introduction

尿酸是人体嘌呤代谢的最终产物。尿酸的过量产生和排泄受阻会导致高尿酸血症。近年来，由于高嘌呤类食物摄入量的增加，高尿酸血症的患病率呈上升趋势。有报道称尿酸性肾病也与高尿酸血症有关。减少摄入高嘌呤类食物、抑制尿酸的合成或促进尿酸的排泄，均能有效控制体内血液中尿酸的水平。

黄嘌呤氧化酶是一种肝酶，催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，黄嘌呤氧化为尿酸。因此，黄嘌呤氧化酶是研发治疗高尿酸血症药物的关键分子靶点。黄嘌呤氧化酶抑制剂（别嘌呤醇、非布司他）广泛用于治疗高尿酸血症。但别嘌呤醇和非布司他有一定的副作用。因此，从食品中鉴定黄嘌呤氧化酶抑制剂已成为治疗痛风的主要方法。

已有研究从鲣鱼、金枪鱼、鲨鱼软骨等海产品中分离出了一些黄嘌呤氧化酶抑制肽。蛋清是生物活性肽的优质来源。先前的研究已经成功地从卵清蛋白、卵类黏蛋白和溶菌酶中鉴定出生物活性肽，如抗氧化肽、免疫活性肽和抗菌肽。因此，卵清蛋白、卵黏液和溶菌酶可用于筛选潜在的黄嘌呤氧化酶抑制肽。然而，传统的生物活性肽分离纯化方法耗时长、成本高。许多研究已经证明虚拟筛选的有效性，因此，虚拟筛选是一种有效的替代传统酶解的方法。

海南大学食品科学与工程学院于志鹏副教授、赵文竹副教授等以鸡蛋蛋白为原料，结合虚拟筛选、分子对接和体外活性验证鉴定新的黄嘌呤氧化酶抑制肽，并揭示了黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤氧化酶抑制肽相互作用的分子机制。这项工作可能为鸡蛋蛋白活性肽在高尿酸血症治疗中的应用提供了新的思路。

Results and Discussion

活性肽虚拟筛选结果

虚拟筛选是一种快速、可靠和高效的生物活性肽筛选方法。从蛋清的卵清蛋白、卵类黏蛋白和溶菌酶的水解产物共得到62 个三肽、四肽和五肽。其中36 条水溶性良好且无毒的活性肽中，有28 条肽与黄嘌呤氧化酶对接成功，其CDOCKER-Energy评分见表1。CDOCKER-Energy评分越低，表明活性肽与黄嘌呤氧化酶结合紧密，从而获得更有利的构象。活性肽EEK、TNDC、EGK、EER和DNEC的CDOCKER-Energy评分较低，分别为：-96.88、-86.44、-86.30、-84.04和 -82.55 kcal/mol，均低于阳性对照别嘌呤醇(5.91 kcal/mol)和非布司他(31.62 kcal/mol)。因此，对活性肽EEK、TNDC、EGK、EER和DNEC进行体外活性研究。

活性肽的黄嘌呤氧化酶抑制活性的体外验证

通过高效液相色谱对活性肽EEK、TNDC、EGK、EER和DNEC的黄嘌呤氧化酶抑制活性进行验证。在0.50 mg/mL浓度下，活性肽EEK的黄嘌呤氧化酶抑制率最高 (73.67%)，活性肽TNDC、EGK、EER和DNEC的黄嘌呤氧化酶抑制率分别为4.38%、10.49%、5.41%和13.24%。因此，我们选择活性肽EEK继续后续的研究。活性肽EEK位于卵清蛋白的第289 ~ 291号残基，表现出最佳的黄嘌呤氧化酶抑制活性， IC50值为141 µmol/L (0.40 mg/mL)。黄嘌呤氧化酶的抑制活性低于抑制剂别嘌呤醇(IC50= 10.10 μg / mL)，但明显优于先前报道的黄嘌呤氧化酶抑制肽WPPKN (IC50 = 17.75 mg/mL)，ADIYTE (IC50 = 19.01 mg/mL)和EEAK (IC50 = 0.58 mg/mL)。

表1 多肽的水溶性、毒性预测及与黄嘌呤氧化酶对接结果

三肽EEK与黄嘌呤氧化酶的相互作用机制研究

黄嘌呤氧化酶是二聚体，每个单体都有一个活性位点，钼中心的Glu802、Glu1261和Arg880残基在催化黄嘌呤氧化中起关键作用，而腔口的Leu648、Phe649、Phe914、Phe1009、Val1011、Phe1013和Leu1014等残基在催化黄嘌呤氧化中起关键作用。EEK与黄嘌呤氧化酶的最佳对接姿势如图1所示。EEK和黄嘌呤氧化酶通过三个碳氢键相互作用(碳氢键相互作用是较弱的氢键，其中供体是一个极化碳原子)、两个盐桥、五个常规氢键和四个电荷吸引力稳定成键。黄嘌呤氧化酶残基Ser876的氢原子(HB1和HB2)与EEK的氧原子(O17)之间形成了两个碳氢键相互作用，长度均为2.82 Å。氨基酸残基Phe1009的氢原子(HA)与EEK (2.45 Å)的氧原子(O14)之间也形成了碳氢键作用。黄嘌呤氧化酶残基Glu879的氧原子(OE2)和Glu802的氧原子(OE1)与EEK通过盐桥相互作用，距离分别为1.82 Å和1.87 Å。EEK的H52，O15， O14， O15， O30分别和黄嘌呤氧化酶上His875的氮原子(NE2)、Arg880的氢原子(HE，HH21)、Thr1010的氢原子(HG1)、Asn768的氢原子(HD22)形成五个常规氢键相互作用。在EEK-黄嘌呤氧化酶复合物中发现了四个电荷吸引力。第一个是由黄嘌呤氧化酶上的Glu879残基的氧原子(OE2)与EEK的氢原子(H51)组成，长度为1.82 Å；第二个为黄嘌呤氧化酶上的残基Arg880的氮原子(NH2)与EEK的氧原子(O15)，长度为3.35 Å；第三个是黄嘌呤氧化酶上的残基Glu802的氧原子(OE1)和EEK的氢原子(H3)，长度为1.87 Å；第四个是残基Lys771的氮原子(NZ)和EEK的氧原子(O30)，长度为4.70 Å。

根据先前的黄嘌呤氧化酶结构的研究分析表明，黄嘌呤氧化酶上 Glu802， Phe1009和Arg880可能在黄嘌呤氧化酶结合中发挥主要作用。三肽EEK与黄嘌呤氧化酶中的原配体槲皮素相比，在与黄嘌呤氧化酶中预测的氨基酸残基(Glu802， Phe1009， Arg880)结合方面更有优势。槲皮素与黄嘌呤氧化酶的Glu802形成了两个不利的化学键，而三肽EEK与Glu802通过盐桥和电荷吸引力稳定结合。槲皮素通过两个Pi - Pi - T型相互作用与黄嘌呤氧化酶的Phe1009连接。相比之下，三肽EEK通过碳氢键作用与黄嘌呤氧化酶的Phe1009键结合。槲皮素与黄嘌呤氧化酶的Arg880通过传统的氢键相互作用结合，三肽EEK与Arg880形成电荷吸引力。三肽EEK与黄嘌呤氧化酶连接形成的碳氢键相互作用和电荷吸引力数量均高于别嘌呤醇、非布司他、EEAK、FH、DN和YLD(图2)。因此，碳氢键相互作用和电荷吸引力可能是筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的关键。

(a) 是EEK-黄嘌呤氧化酶配合物的三维结构，红色为黄嘌呤氧化酶残基氨基酸，黑色表示黄嘌呤氧化酶中的原子序数，蓝色代表肽EEK中的原子编号。(b)图为 EEK-黄嘌呤氧化酶分子相互作用的2D示意图。浅蓝色代表碳氢键，绿色代表常规氢键，橙色代表盐桥和静电相互作用，红色代表不利的负-负相互作用。

图1 EEK与黄嘌呤氧化酶对接的相互作用

(a）为原配体槲皮素与黄嘌呤氧化酶的对接情况。绿色代表常规氢键。浅蓝色代表pi -供体氢键。亮粉色表示Pi-Pi堆叠和Pi-Pi t形交互作用。粉色代表π -烷基相互作用。紫色代表相互作用。红色代表不利的碰撞和不利的受体-受体相互作用。(b)、(c)、(d)、(e)、（f）（g）分别为别嘌呤醇、非布索坦、多肽EEAK 、FH 、DN 和YLD 与黄嘌呤氧化酶的分子相互作用。

图2 活性肽与黄嘌呤氧化酶互作

Conclusion

本研究从鸡蛋蛋白中鉴定出具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的三肽EEK， IC50值为141 µmol/L。三肽EEK通过三个碳氢键、两个盐桥、五个常规氢键和四个吸引电荷作用力与黄嘌呤氧化酶活性中心结合。Glu802， Phe1009和Arg880是三肽EEK与黄嘌呤氧化酶相互作用的关键氨基酸。碳氢键相互作用和电荷吸引力在EEK与黄嘌呤氧化酶的关键氨基酸残基(Glu802， Phe1009和Arg880)相互作用中起主要作用。三肽EEK是一种很有前景的天然黄嘌呤氧化酶抑制剂，可用于控制高尿酸血症。

第一作者简介

于志鹏，博士，副教授、硕士生导师。研究主要集中于ACE抑制肽（降血压活性肽）、降血糖活性肽和抗老年痴呆活性肽的酶解制备、结构鉴定；基于分子模拟的作用机制及稳态化保护机制研究；基于食品组学技术探究活性肽的体内作用机制。目前，以第1 作者/通讯作者发表SCI 检索论文45 篇（其中中科院JCR 大类分区一区21篇）；申请有关活性肽等功能因子的国家发明专利50项，其中以第1 发明人获得授权专利16项，完成成果转化1项。

通信作者简介

赵文竹，博士，副教授、硕士生导师。目前主要研究的方向为借助计算机辅助靶向筛选果蔬活性因子、糖蛋白结构的鉴定及果蔬类功能性产品的开发；主持国家自然科学基金和省教育厅项目，参与国家重点研发计划专项和省科技厅项目，2014-2019年获得多项省自然学术成果奖及市自然学术成果奖。以第一或通讯作者发表科研论文50余篇，其中SCI检索论文20余篇；授权有关果蔬糖蛋白、活性多肽等国家发明专利5项，完成成果转化1项。现任Food Chemistry, Food Hydrocolloids 及Journal of the Science of Food and Agriculture等SCI检索期刊的评审专家。

Identification of egg protein-derived peptides as xanthine oxidase inhibitors: virtual hydrolysis, molecular docking, and in vitro activity evaluation

Zhipeng Yu^a, Yaxin Cao^b, Ruotong Kan^b, Huizhuo Ji^b, Wenzhu Zhao^a^,*, Sijia Wu^c, Jingbo Liu^c, David Shiuan^d

^aSchool of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou 570228, China

^bCollege of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China

^cLab of Nutrition and Functional Food, Jilin University, Changchun 130062, China

^dInstitute of Drug Discovery Technology, Ningbo University, Ningbo 315211, China

*Corresponding author.

E-mail address: zhaowenzhu777@163.com

Abstract

The purpose of this study was to screen the xanthine oxidase (XO) inhibitory peptides from egg white proteins through virtual hydrolysis, in vitro activity validation, and molecular docking. The results demonstrated that tripeptide EEK from ovalbumin exhibited potent XO inhibitory activity with an IC50 value of 141 µmol/L. The molecular docking results showed that tripeptide EEK bound with the active center of XO via 3 carbon hydrogen bond interactions, 2 salt bridges, 5 conventional hydrogen bond interactions, and 4 attractive charge interactions. The residues Glu802, Phe1009, and Arg880 may play key roles in the XO catalytic reaction. Especially, the key intermolecular forces of inhibiting XO activity may be special type of hydrogen bonds including carbon hydrogen bond interactions and attraction charge interactions. The novel tripeptide EEK is potential candidates for controlling hyperuricemia.

Reference:

YU Z P, CAO Y X, KAN R T, et al. Identification of egg protein-derived peptides as xanthine oxidase inhibitors: virtual hydrolysis, molecular docking, and in vitro activity evaluation[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(6): 1591-1597. DOI:10.1016/j.fshw.2022.06.017.

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