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哈尔滨商业大学王艳副教授等：甲烷氧化菌素耦合脂肪酶生物传感器差分脉冲伏安法对Cu2＋的检测

2022-11-17作者：来源：食品科学杂志责任编辑：食品界字体A+AA-

环境中的铜易在人体中富集，根据世界卫生组织规定，饮用水中Cu^2＋质量浓度标准为不高于2.0 mg/L，当血清中Cu^2＋累计量超过0.035 mmol/L，会造成铜中毒。现有Cu^2＋检测方法有光谱法、电感耦合等离子体质谱法、离子色谱法、分光光度法等，其中大部分方法存在一些限制性和弊端，如耗时较长、灵敏度低、操作繁琐、仪器昂贵以及依赖实验室专业的人员进行检测等缺点，不利于现场快速检测实际应用。电化学分析法是一种公认的快速、灵敏、准确的痕量元素分析法，操作简单、价格低廉，是其备受关注的突出优势。目前电化学法对Cu^2＋检测灵敏度和选择性较低，差分脉冲伏安（DPV）法相较于循环伏安法灵敏度更高，电流响应信号与表面电解的待测物总量呈比例关系，可进行定量检测。

甲烷氧化菌素（Mb）是由甲烷氧化菌生长过程中分泌的一种生物分子，是一种具有极高铜亲和力的蛋白活性肽，Mb中游离的巯基与胺基可与纳米金（AuNPs）通过Au—S和Au—N键键合，并且Mb特异性捕获环境中的铜且对Cu^2＋具有较强的专一性。

哈尔滨商业大学，食品科学与工程重点实验室的王艳、赵宁、王悦等通过循环伏安法对Mb耦合脂肪酶生物传感器考察传感器构建的电化学响应情况，采用DPV实现对Cu^2＋的特异性定性、定量检测研究，其原理如图1所示。基于层层组装技术构建Mb耦合脂肪酶生物传感器（Mb/Lipase@AuNPs-Gold Electrode），脂肪酶催化三油酸甘油酯的水解反应为基础反应模型，以三油酸甘油酯为底物分子，生物传感器可检测水解底物时产生的电流信号，利用Mb可特异性捕获Cu^2＋的特性，实现Cu^2＋在脂肪酶周围产生富集现象，从而抑制脂肪酶的催化活性，导致电流强度迅速下降，通过考察加入Cu^2＋前后电流信号差值，实现对Cu^2＋的快速定性、定量检测。本研究构建的脂肪酶生物传感器可解决现有电化学检测Cu^2＋灵敏度和专一性低、检出限高的问题，为实现Cu^2＋现场快速定量检测提供新的思路和研究基础。

01固定化脂肪酶构建机制分析

透射电镜表征固定化脂肪酶

透射电镜下观察AuNPs溶液与固定化脂肪酶，如图2A所示，AuNPs溶液中AuNPs颗粒分散均匀且粒径均一，图2B固定化脂肪酶溶液中由于脂肪酶通过共价键固定在AuNPs颗粒上，并未改变AuNPs颗粒粒径，但AuNPs颗粒分布相对紧密，可证明脂肪酶固定成功。

光谱表征固定化脂肪酶

如图3A所示，AuNPs与脂肪酶结合后在520 nm处出现新特征吸收峰，固定化脂肪酶制备成功后此特征吸收峰发生红移现象，且此时280 nm附近的氨基酸紫外特征吸收峰会下降，结果表明脂肪酶已成功固定在AuNPs上，使得AuNPs粒子与脂肪酶分子聚合程度上升。猪胰脂肪酶中的荧光基团可以与猝灭剂发生分子间作用，如激发态反应、分子重排、能量转移、形成基态络合物和分子碰撞等，均可引发荧光的猝灭。当激发波长为280 nm时，色氨酸和酪氨酸同时被激发。

如图3B所示，当激发波长λex为280 nm时，酶液中加入AuNPs后，λex/λem＝280/342 nm处的色氨酸和酪氨酸的特征发射峰明显降低，荧光基团发生猝灭现象，脂肪酶的发射波长产生轻微的红移，由342 nm红移至345 nm，当固定化脂肪酶制备成功时，发射波长再次红移至351 nm，这说明两种氨基酸残基均已暴露，固定化脂肪酶制备成功形成激基复合物导致波长变长。

脂肪酶与固定化脂肪酶变化红外图谱对比如图3C所示，3 437 cm^－1处为不饱和碳上有强极性O—H发生伸缩振动，2 319 cm^－1处形成新的叁键和累计双键区C≡N发生伸缩，1 638 cm^－1的C＝C伸缩振动明显增强，可能是由于—SH与AuNPs溶液中羧酸的C＝O发生键和，此处特征吸收峰增强，980 cm^－1可能为C—O伸缩振动，872 cm^－1处为＝CH2发生面外摇摆，607 cm^－1和531 cm^－1可能为C—S和C—N，525 cm^－1处为—S—S—的伸缩振动明显减弱，表明脂肪酶中的二硫键与AuNPs粒子发生偶联，形成了Au—S离子共价键。鉴于二硫键在维持蛋白质结构稳定性的重要性，以及紫外与荧光光谱结果可知固定化脂肪酶制备成功。

02Mb耦合脂肪酶生物传感器构建方法筛选

在电解液溶液中，只修饰AuNPs溶液的金电极：由于AuNPs有放大电流信号的能力，电极导电性增强，比裸金电极捕捉电信号的能力更加灵敏，电流值增加了8.802 µA；3 种方式构建的Mb耦合脂肪酶生物传感器，电沉积法、浸泡法、滴涂法电流信号依次递增，滴涂法比裸电极电流信号降低了17.861 µA，浸泡法比裸电极电流信号降低了21.992 µA，电沉积法比裸电极电流信号降低了27.093 µA，结果见图4，说明电沉积法构建脂肪酶生物传感器的效果最好。

图5中3 种方法制备的单层组装Mb耦合固定化脂肪酶的酶生物传感器分别在三油酸甘油酯为底物的反应体系中检测：电沉积法电流信号值为18.449 µA、浸泡法电流信号值为12.908 µA、滴涂法电流信号值为11.426 µA，电沉积法、浸泡法、滴涂法构建的脂肪酶生物传感器检测电流峰值依次递减，两项结果均表明电沉积法修饰固定化脂肪酶的效果最佳，因此本研究选择电沉积法构建脂肪酶生物传感器。电沉积法可达成修饰电极理想化按设计顺序修饰，且目标物有序、相对致密，修饰的稳定性相较于滴涂法与浸泡法更高。

03Mb耦合脂肪酶生物传感器构建表征

如图6A所示，在电解液溶液中裸电极表面修饰AuNPs可以放大电流信号，随着修饰的脂肪酶层数不断增加，电信号逐渐减弱。如图6B所示，交流阻抗法检测中实部电阻-虚部电阻曲线圆弧逐渐变大，显示传感器表面电阻不断增加的同时，也证明酶生物传感器构建成功。

在三油酸甘油酯为底物的检测体系中，传递的电流强度很弱，裸电极只能捕捉到微弱的氧化还原电信号；随着电沉积法构建脂肪酶生物传感器酶层数不断增加，氧化还原反应逐渐增强，电信号强度递增，但层数为4 层时，在检测体系中电信号骤减，结果如图7所示，层数越多会形成空间位阻效应，活性中心互相遮盖掩埋，并影响传感器对电流信号的感应效果，且形成Au—S键共价键键和强度弱于自身重量也会引起断裂；但修饰层数过少，则信号传递效率、传感器响应面及有效换能没有达到饱和，使得检测的灵敏度过低，因此选择3 层为最优的修饰脂肪酶层数。

04DPV法Cu^2＋检测体系的优化

脂肪酶生物传感器催化底物质量浓度的确定

如图8A所示，在0.2 V附近电流达到峰值，如图8B所示，质量浓度为2 g/100 mL三油酸甘油酯溶于Tirs-HCl缓冲溶液时电信号强度最大为8.795 μA，构建脂肪酶生物传感器上酶数量一定，酶催化活性中心的活性位点数量也一定，当底物质量浓度过高时，酶的催化活性中心可传递电信号的活性位点会被掩盖发生衰减现象，与此同时检测体系的双电层扩散系数会减小，传感器同时期捕获的电流信号会成倍降低。当底物质量浓度过低时酶促反应没达到饱和，此时虽然检测体系的双电层扩散系数大于相对三油酸甘油酯质量浓度过大时的系数，质量浓度对脂肪酶生物传感器上的酶促反应传递电信号能力有影响，相较于两者平衡时的电信号强度而言，体系双电层的介电系数达到饱和，因此选择三油酸甘油酯溶于Tirs-HCl缓冲溶液，2 g/100 mL为最佳反应底物质量浓度。

脂肪酶生物传感器催化三油酸甘油酯最佳pH值的确定

如图9A所示，在电位0.2 V时氧化峰电流达到最大值，如图9B所示，pH 7.5时电信号强度最大为15.81 μA，pH值对脂肪酶催化活性有明显影响，当双电层界面扩散系数一定时，酶促效果与电信号强度呈正比，pH值的不同会改变酶的二级结构以及三级结构，酶的活性氨基酸以及残基会部分或全部失活，酶促反应无法正常进行，此时脂肪酶生物传感器活性位点传递信号的强度成倍衰减，因此选择pH 7.5的脂肪酶催化体系为最佳检测体系。

05Cu^2＋检测线性范围拟合曲线、检出限

如图10所示，线性回归方程为y＝0.228x＋0.774 8（R²＝0.995 0），表明Cu²^＋浓度在1～100 nmol/L区间与电流信号下降高度之间线性关系良好，经计算得检出限为0.03 nmol/L。

06Cu^2＋检测体系抗干扰性能

如图11所示，当检测体系中加入Cu²^＋溶液时电流成阶梯状有序下降，但依次每隔50 s加入20 μL浓度为5 μmol/L Ca²^＋、Mg²^＋、Zn²^＋、Hg²^＋、Pb²^＋、Ba²^＋、Ni²^＋溶液时脂肪酶生物传感器感应电流强度无变化，说明在超痕量的检测范围内此脂肪酶生物传感器对Cu²^＋检测具有特异性，其他常见的二价金属、非金属离子对本检测体系无干扰。

07酶生物传感器的稳定性以及使用寿命

如图12所示，在第14天对Cu²^＋响应的峰电流达到86.96%，说明该脂肪酶生物传感器稳定性良好，随着检测次数的增加与构建时间的延长，脂肪酶催化底物的活性位点逐渐减少导致重复性下降、检测性能降低，因此在传感器有效检测时间内及时使用。

传感器每次检测Cu²^＋后用缓冲溶液进行活性位点释放处理，可实现一支传感器多次使用的目的，实验发现用同种方式进行传感器的活性位点释放前10 次检测，结果如图13所示，相对标准偏差为2.19%；在11～20 次，相对标准偏差为2.87%；在21～30 次，相对标准偏差为3.48%；在31～40 次，相对标准偏差为4.55%；在41～50 次，相对标准偏差为8.03%（＞5%），由此可知，此脂肪酶生物传感器在40 次重复利用时可保持良好的检测性能，但是在40 次以上电流信号感应衰减情况显著，此现象可能是因为传感器上的脂肪酶在每次释放、检测往返过程中部分活性位点掩盖甚至失活，酶促反应的电信号传递缺失，或本来可传导信号的活性中心因为失活，电信号湮灭，因此本脂肪酶生物传感器在使用寿命上可完成在40 次左右的重复检测效果良好。

结论

利用电沉积法通过层层组装AuNPs、固定化脂肪酶、Mb构建脂肪酶生物传感器，实验表明本法固定化脂肪酶修饰层数为3 层时制备的传感器最稳定；脂肪酶催化底物三油酸甘油酯的检测体系中三油酸甘油酯溶于100 mL的Tirs-HCl缓冲溶液质量浓度为2 g/100 mL、pH 7.5时传感器捕获电流信号响应值最高；Cu²^＋浓度为1～100 nmol/L线性范围内拟合程度最好，线性方程为y=0.228x＋0.774 8（R²=0.995 0），检出限为0.03 nmol/L（RSN=3）且在此超痕量的检测范围内，浓度为1 μmol/L的Ca²^＋、Mg²^＋、Zn²^＋、Ba²^＋、Hg²^＋、Pb²^＋等常见的二价金属、非金属离子同时存在时，其他金属对Cu²^＋检测无干扰；此体系检测Cu²^＋的抗干扰能力出色；在超痕量范围内采用DPV可实现对同离子现场快速、定量检测、检测时间仅需10 s，解决了目前对Cu²^＋检测不能现场快速检测的实际问题。本研究建立的新型脂肪酶生物传感器检测Cu²^＋的方法，具有较高的灵敏度、专一性和稳定性，为食品中痕量、超痕量重金属检测领域奠定了研究基础。

第一作者简介

王艳，女，博士，哈尔滨商业大学食品工程学院副教授，硕士导师，科研秘书，1984年3月出生于吉林省白山市。主要从事生物技术在农副产品增值化创制和食品安全快速检测中的应用研究，取得了富有创新性的研究成果。实现了谷物淀粉的增值化改造，制备出中长链脂肪酸淀粉酯、阿魏酸淀粉酯等新型功能性食品添加剂和前体手性药S-萘普生淀粉酯；通过甲烷氧化菌素功能化纳米金的研制，实现了铜离子的特异性可视化快速检测，并利用甲烷氧化菌素功能化纳米金对金电极进行修饰，实现了食品中铜离子和有机磷的特异性痕量检测。共发表学术论文65篇，其中SCI收录10篇，EI收录16篇，1篇论文获奖，黑龙江省科学技术奖（自然类）二等奖1项，黑龙江省高校科学技术一等奖2项，黑龙江省高校科学技术二等奖2项，荣获黑龙江省自然科学技术学术成果奖二等奖1项。主持或参与科研项目25项，其中国家自然科学基金3项，黑龙江省“百千万”重点研发项目1项，龙江省杰出青年科学基金1项，黑龙江省自然科学基金2项，黑龙江省应用技术研究与开发计划项目1项，中央支持地方高校改革发展资金人才培养支持计划项目（高水平人才）1项，厅局级项目10项，横向课题6项。授权国家发明专利3项，出版专著3部，教材1部。

本文《甲烷氧化菌素耦合脂肪酶生物传感器差分脉冲伏安法对Cu^2＋的检测》来源于《食品科学》2022年43卷16期351-358页，作者：王艳，赵宁，王悦，李虹佳，辛嘉英，孙立瑞，关桦楠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210621-249。点击https://www.spkx.net.cn/article/2022/1002-6630/2022-43-16-045.html即可查看文章相关信息。