河南省农业科学院动物免疫学重点实验室的孙亚宁、杨苏珍、张改平*等利用磁性纳米颗粒和绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体一步法制备磁性荧光抗体探针，建立DON磁荧光免疫层析试纸，并将其应用于谷物中DON污染物的检测中；同时建立DON胶体金免疫层析试纸，对比两种方法的灵敏度，判定新模式的有效性。本研究采用一步法制备磁性荧光抗体探针应用于的免疫层析检测技术中，同步实现样品的富集及荧光信号的检测，从而提高检测灵敏度，促进磁荧光纳米颗粒在免疫检测领域的广泛应用，为更灵敏的免疫层析检测方法提供技术支撑。

01 超顺磁颗粒的表征

分别调整反应体系中三氯化铁及柠檬酸钠使用量，改变磁性颗粒的粒径，结果见表1，保持整个体系其他成分不变时，磁颗粒粒径随着反应体系中三氯化铁所占比例增加磁颗粒的粒径增大。磁颗粒分布见图1，结合图1及表1结果显示，1号磁颗粒的分布峰更窄，标准偏差更小，从而说明1号磁颗粒径均一性更好。对1号磁性颗粒进行透射电镜扫描结果见图2，结果显示磁纳米颗粒呈现规则的球体。磁力鉴定实验结果显示：在外加磁场作用下，磁颗粒可在1 min内被完全吸附于瓶底，说明制备的磁颗粒具有较好的磁性，可以用于后期靶标物的富集检测。

02 DON磁荧光抗体探针鉴定及优化

磁荧光抗体探针的磁性鉴定结果见图3A，结果显示在外加磁场作用下磁颗粒在1 min内可以完全被吸附于反应杯底部，说明探针具有很好的磁性；探针免疫学及荧光性能鉴定结果见图3B及3C，结果显示磁荧光抗体探针可以被NC膜上固定的SPA拦截，说明磁颗粒与DON单克隆抗体偶联成功，且具有很好的活性；磁荧光抗体探针的荧光特性鉴定结果见图3C，将图3B中试纸用荧光读条仪扫描，结果显示，在SPA拦截线位置有较强的荧光信号。综上所述本实验通过一步法偶联的DON磁荧光抗体探针制备成功。

DON磁荧光抗体探针制备过程中优化了绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体的加入量，结果见图4。当200 μL磁珠中加入蛋白量低于1.25 μg时，磁吸附上清液中荧光信号完全消失（吸附接近100%），随着蛋白量的增加，磁珠吸附荧光值快速增加，吸附比逐渐下降。当蛋白加入量达到5 μg时，吸附比仅为40.87%，有超过一半的荧光信号残留于上清液中，说明蛋白加入已经过量，但5 μg时吸附荧光值远大于2.5 μg时，因此确定每200 μL磁珠中加入5 μg蛋白为较优蛋白量。

03 试纸灵敏度的检测

DON磁荧光免疫层析试纸裸眼观测结果见图5A，用荧光读条仪扫描获得荧光曲线见图5B，利用峰面积值绘制标准曲线，回归方程为y=-0.562x+0.921，R²=0.990，经计算试纸定量的IC50为5.611 ng/mL，检出限为1.089 ng/mL；DON胶体金免疫层析试纸灵敏度的结果见图6，裸眼检测灵敏度为500 ng/mL（图6A）；利用读条仪扫描灰度曲线为图6B，根据峰面积绘制标准曲线，回归方程为y=-0.543x+1.485，R²=0.991，经计算试纸定量的IC50为65.16 ng/mL，检出限为11.94 ng/mL。比较两种方法的IC50，结果显示DON磁荧光免疫层析试纸是胶体金免疫层析试纸灵敏度的10.96 倍。

04 试纸特异性的检测

表2显示：DON胶体金免疫层析试纸与常见真菌毒素AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2交叉反应率低于0.65%，DON磁荧光免疫层析试纸与常见真菌毒素AFB1、OTA、ZEN、FB1、T-2交叉反应率低于0.06%，说明本实验建立的两种DON免疫层析试纸具有很好的特异性。

05 DON磁荧光试纸荧光信号稳定性检测

由于DON磁荧光免疫层析试纸跑板需要8～10 min，为了在干净的背景下观测荧光信号，因此选择10 min后进行磁荧光信号稳定性检测，结果见图7，荧光信号随着时间的延长呈明显下降的趋势。因此应严格控制试纸结果判定时间，在试纸检测10 min左右读取结果。

06 DON磁荧光试纸加标回收实验

检测DON加标阳性小麦样品5 份，实验结果见表3。添加回收率在81.447%～98.558%之间，平均值为87.378%；变异系数在14.462%～19.662%之间，平均值为17.351%，均小于20%，说明该检测方法具有很好的准确性和精密度。

本文《高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用》来源于《食品科学》2022年43卷18期310-317页，作者：孙亚宁，杨苏珍，杨继飞，胡骁飞，陈鑫鑫，张颖硕，邓瑞广，张改平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210721-259。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。