贵州大学陶菡副教授等：基于1T-WS2@AuNPs复合材料的白芸豆酯酶电化学生物传感器构建及其杀螟硫
2022-12-12作者：来源：食品科学杂志责任编辑：食品界
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作为现代农业中使用最广泛的农药，有机磷农药（OPPs）在保护农作物免受虫害和提高农作物产量方面发挥着重要作用。不幸的是，由于它在世界范围内的滥用，对水、土壤甚至农产品造成了严重的污染。OPPs进入人体内会引起乙酰胆碱酯酶活性的不可逆抑制，进而导致中枢神经系统的紊乱，甚至威胁生命。因此，开发一种灵敏、快速、可靠和经济的方法检测OPPs相当重要。相比之下，电化学传感检测技术具操作简单、检测迅速、灵敏度高、成本低等优点，非常适合于OPPs残留的简便快捷、灵敏可靠检测。
贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室的田运霞、吴远根、陶 菡*等构建来源于白芸豆的植物酯酶基电化学生物传感器，利用1T-WS2@AuNPs纳米复合材料优异的理化性能增敏传感信号，并对其农药检测性能和实际应用性能进行评价。杀螟硫磷检测原理如图1所示，芸豆酯酶（KbE）催化水解底物1-乙酸萘酯（1-NA）产生电化学活性物质1-萘酚，当体系中存在农药杀螟硫磷时，KbE活性会被抑制，导致1-萘酚的产生减少，相应的电化学响应信号也会降低，从而实现杀螟硫磷的定量检测。
由图2A可知，1T-WS2呈片状，并且1T-WS2纳米片组成了具有大量孔隙的空间结构且结构分布均一。这些空隙一方面能够增加1T-WS2的比表面积，为酶的附着提供更多位点；另一方面也为酶促反应提供了足够的反应环境，促进反应的进行。图2B表明，AuNPs是均匀的球形颗粒，平均粒径为13.5 nm，且较为均匀地附着在1T-WS2的片状表面。由图2C可知，1T-WS2纳米片中含有钨、硫、氮等元素。从图2D可知，与2H-WS2相比（软件拟合所得），1T-WS2对应的峰向低结合能处偏移了约0.5 eV。同样，硫元素2p高分辨率谱图（图2E）也表现出相似的趋势，以上峰结合能的变化与相关文献报道一致，表明本实验制备的1T-WS2纳米片中，1T相占主导地位。为进一步确定1T相的存在，采用拉曼光谱对1T-WS2纳米片的结构进行了鉴定。如图2F所示，在347 cm-1和411 cm-1处有两个明显的特征峰，分别对应于WS2中面内（E12g）和层间（A1g）两种分子振动模式。此外，在低频区域出现了几个新的峰，这文献报道一致，表明1T-WS2制备成功，这与XPS的表征结果也相对应。
如图3A所示，4 种电极均出现一对氧化还原峰。与裸电极相比，1T-WS2/GCE修饰电极上的氧化和还原峰电流明显增大；同时，峰电位差从裸电极的173 mV减小到138 mV，这归因于1T-WS2的高导电性。与AuNPs复合后，Fe2+/Fe3+电对的氧化和还原电流值进一步增大且峰电位差减小至103 mV，表明1T-WS2@AuNPs修饰电极具有更优异的电化学性能，这与AuNPs良好的导电性有关；因此将AuNPs引入1T-WS2可以进一步提高电极的导电性，从而加速电子的传递。由于KbE和CS为不导电的生物分子，阻碍了电子的传递，所以观察到CS/KbE/1TWS2@AuNPs/GCE修饰电极上的氧化还原电流下降且峰电位差增加。进一步研究不同修饰电极的电化学特性，如图3B所示，每条曲线都是由高频区的一个半圆与低频区的一条直线组成，其中高频区的半圆直径大小反映了电极的电荷转移电阻大小。1T-WS2@AuNPs/GCE修饰电极的半圆直径最小，即电荷转移电阻最小，表明1T-WS2@AuNPs具有优异的电子转移能力。随着KbE和CS的进一步修饰固定，半圆直径明显增大，CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE的电子转移能力最差。上述结果与CV测试结果一致，同时表明CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE生物传感器被成功构建。
由图4可知，在不含1-NA的磷酸盐缓冲液中，CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE修饰电极的SWV曲线平滑，无峰电流响应产生；加入1-NA后，出现一个明显的氧化峰，说明此峰是由KbE水解1-NA生成的1-萘酚在电极上被电化学氧化而产生。以上结果表明KbE被成功固定在电极上并保持其生物活性。此外，相比于CS/KbE/GCE电极，CS/KbE/1T-WS2/GCE、CS/KbE/AuNPs/GCE、CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE修饰电极上所产生的氧化峰电流增大且出峰电位减小。4、CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE修饰电极制备及测试条件优化
如图5A所示，随着pH值的增大，电流响应先增大后减小，在pH 7.0处具有最高电流响应。因此pH 7.0为最优pH值，后续实验使用pH 7.0的磷酸盐缓冲液。1T-WS2与AuNPs体积比和1T-WS2@AuNPs负载体积的影响
如图5B所示，1T-WS2与AuNPs的最佳体积比为1∶1。适量的纳米材料修饰到电极上可以增大电极的比表面积，促进电极与电活性物质之间的电子转移。如图5C所示，当1T-WS2@AuNPs负载体积从6 μL增加到12 μL，峰电流随负载体积增加而增大，于12 μL时达到最大；当负载体积进一步增加，峰电流值逐渐下降，这可能因为过厚的膜会阻碍电子传递。因此，选择12 μL作为1T-WS2@AuNPs纳米复合物的最佳负载体积。如图5D所示，随着负载的KbE酶活力的增加，传感器的响应电流值变大，在0.13 U时达到最大值；继续增加负载的KbE酶活力，峰电流值略有下降，这是因为KbE是蛋白酶，导电性很差，过量的酶会阻碍电子在传感器表面的传递。因此，0.13 U为负载的最佳酶活力。从图5E可以看出，随抑制时间延长，酶活性下降越多，导致生成的1-萘酚越少，抑制率上升；当抑制时间超过15 min时，由于酶活性位点与农药的饱和结合，酶的抑制程度也趋于稳定。因此，以15 min作为最佳抑制时间。5、CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器杀螟硫磷的标准曲线
图6A表明CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器的峰电流值整体随着杀螟硫磷质量浓度的增加而减小，农药对酶活性的抑制逐渐增强。由图6B可知，在0.1～2 000 μg/L范围内，抑制率与杀螟硫磷质量浓度（lgC）呈良好的线性关系，其线性标准方程为Y＝14.82lgC+24.18，相关系数（R2）为0.992，检出限为0.04 μg/L（信噪比为3）。将CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器与已报道的其他检测方法进行比较（表1），结果表明本研究构建的传感器具有较宽的线性区间和检出限；此外，还具有制备简单、成本低等优点。说明将植物酯酶替代来源于动物的胆碱酯酶进行农药的高效检测切实可行，具有进一步开发应用的价值。6、CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器重复性、稳定性和抗干扰能力分析
如图7所示，当存在5 mmol/L的葡萄糖、柠檬酸、草酸、SO42－、Cl-、K+和Fe3+时，对SWV响应信号没有造成显著影响（P＞0.05）；但当存在50 μg/L的百草枯和多菌灵时，响应信号分别下降至70.96%和64.49%，可能是百草枯作为毒性较强的农药，对KbE有一定的抑制作用，而多菌灵是氨基甲酸酯农药的一种，对KbE也有抑制作用，这与文献中报道的一致。结果表明，该CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器具有良好的抗干扰能力。7、CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE传感器在实际样品中应用分析
如表2所示，回收率为96.16%～109.60%，相对标准偏差小于5%，表明该生物传感器具有良好的实用性，有望应用于实际样品中OPPs的检测。制备了具有良好电催化活性的1T-WS2@AuNPs纳米复合物，并以KbE代替乙酰胆碱酯酶构建新型电化学生物传感器，将其用于杀螟硫磷的简便、高效检测。SEM和TEM表征结果表明1T-WS2@AuNPs纳米复合物具有大比表面积，可为酶的负载提供良好的微环境，同时电化学表征表明1T-WS2@AuNPs具有良好的导电性和协同电催化效应可以有效促进电子的传递，提高传感器的响应灵敏度。与传统分析方法相比，该电化学传感器成本低、制备简单、灵敏度高，在OPPs检测中具有潜在的应用价值，并为植物酯酶在农药残留检测方面的应用提供一定理论和技术基础。
陶菡，副教授，贵州大学酿酒与食品工程学院硕士生导师。1994-1998年，就读于湖南大学化学化工学院并获学士学位；2001-2004年，就读于湖南大学生物传感与计量学国家级重点实验室并获硕士学位；2006-2011就读于贵州大学农学院并获博士学位。在贵州大学从事教学科研工作，现为酿酒与食品工程学院硕士生导师及贵州省发酵工程与生物制药重点实验室科研人员。主要研究方向为食品质量与安全检测新技术。目前研究兴趣主要集中在利用化学与生物传感技术，以天然酶、人工酶、适配体、抗原抗体等为信号识别分子，结合纳米技术，筛选并建立食品中常规成分或危害成分的实验室检测或现场实时检测新方法。先后主持和参加过国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金项目、863计划专题、贵州省科学技术项目、贵州省科技厅农业攻关项目等多项课题。目前已在国内外期刊上发表论文60余篇（SCI收录23篇），包括Microchimica Acta、Journal of Colloid and Interface Science、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Agriculture-Basel、Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry、Analytical Methods、RSC advances、New Journal of Chemistry等英文期刊。
田运霞，女，1996年3月生。2014-2018年，就读于青岛农业大学食品科学与工程学院并获学士学位；2018-2021年，就读于贵州大学酿酒与食品工程学院并获硕士学位。研究方向为食品质量与安全检测新技术。先后获得贵州大学硕士一等奖学金、硕士三等奖学金，贵州大学优秀共青团员等荣誉。
