食品界

东北农业大学隋晓楠教授等：矢车菊素-3-葡萄糖苷与大豆蛋白相互作用的多重光谱分析及分子对接

黑米作为我国一类有色稻米，因其良好的口感和香气而被广泛食用。黑米中主要花青素有矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）和芍药色素-3-葡萄糖苷，前者的含量明显高于后者。但由于易受pH值、温度、辐射与氧气等环境因素的影响，花青素加工稳定性差，生物利用度低下，成为在食品工业应用中的最大阻碍。近年来，由于蛋白质优异的生物相容性和良好的功能特性，以蛋白质为载体的多酚稳定方式引起了众多学者的研究兴趣。

东北农业大学食品学院的黄国，陈骐，隋晓楠*等人在前人研究基础上以C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白为研究对象，借助多重光谱以及分子模拟对接等技术手段，揭示C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白之间的相互作用，深入分析C3G与大豆蛋白的互作机理与差异。该研究旨在分子水平上为花青素的保护提供见解，从而更深层次了解大豆蛋白对花青素等酚类物质的稳态化作用及生理活性特性的影响。

内源荧光光谱分析

C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白内源荧光光谱的影响

如图1所示，C3G的加入使蛋白的内源荧光强度降低，降低程度与C3G的添加量呈正相关，说明C3G可以猝灭β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的内源荧光，且具有浓度依赖性。另外，大豆球蛋白的荧光强度远大于β-伴大豆球蛋白，可能是由于大豆球蛋白具有更高含量的Trp和Tyr残基导致。C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的猝灭效率分别为（62.14±1.06）%和（70.35±1.14）%，即C3G与大豆球蛋白的相互作用更强。

猝灭类型、表观结合常数及结合位点数

图2和表1表明，随着温度的提高，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的Stern-Volmer方程线性斜率逐渐增大，说明存在动态猝灭。但C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的荧光猝灭速率（1012 L/（mol·s）），远大于最大扩散碰撞猝灭常数（2×1010 L/（mol·s）），表明猝灭方式中也存在静态猝灭。

如图3和表2所示，一方面，C3G和β-伴大豆球蛋白之间的Ks值随着温度的升高而增加，这表明C3G-β-伴大豆球蛋白的形成是吸热反应，其稳定性随着温度的升高而增加；而大豆球蛋白则相反，表明升温不利于复合物的稳定。另一方面，大豆球蛋白较β-伴大豆球蛋白具有更大的Ks值，并大于104数量级，说明C3G对大豆球蛋白的结合亲和力强于β-伴大豆球蛋白。此外，2 组复合物的结合位点数n均接近于1，说明C3G与2种蛋白均形成了物质的量比约为1∶1的静态复合物。

热力学参数及作用力类型

如表3所示，C3G与β-伴大豆球蛋白结合时，ΔG＜0、ΔH＞0、ΔS＞0，说明两者发生了吸热的自发结合，且疏水作用力是两者结合的主要结合力；而C3G与大豆球蛋白结合时，ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＜0，说明二者之间的相互作用是自发的放热反应，范德华力和氢键为两者结合的主要结合力。

同步荧光光谱分析

如图4所示，Trp残基的荧光强度明显大于Tyr残基，表明Trp残基是蛋白荧光的主要贡献者。随着C3G浓度的增加，Trp残基的荧光猝灭程度远强于Tyr残基，这可能表明Trp残基比Tyr残基对蛋白质荧光的猝灭贡献更大。对于Tyr残基，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的最大吸收波长变化均不明显，表明C3G对大豆蛋白的Tyr残基微环境的影响较小。对于Trp残基，大豆球蛋白最大吸收波长变化不明显，而β-伴大豆球蛋白的最大吸收波长产生轻微的红移；这暗示C3G可能诱导β-伴大豆球蛋白的Trp残基微环境向亲水环境转变，且与Tyr残基相比，结合位点可能更靠近Trp残基。而对大豆球蛋白Trp残基微环境无明显影响。

三维荧光光谱分析

如图5所示，峰1（λEm＝340 nm，λEx＝280 nm）、峰2（λEm＝350 nm，λEx＝230 nm）、峰a（λEm＝λEx）和峰b（λEm＝2λEx）分别对应于Trp和Tyr残基的荧光特征峰、多肽链骨架结构的特征峰、瑞利散射和拉曼散射的特征峰。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的拉曼散射峰都有所降低，表明C3G-大豆蛋白复合物的形成并降低了光散射作用；C3G的添加猝灭了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白峰1的荧光强度，表明大豆蛋白部分Trp、Tyr残基与C3G发生强烈的相互作用。此外，峰2的荧光强度也有所降低，这表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白多肽链的展开和解折叠。

FTIR光谱分析

如图6所示，C3G的加入使β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的酰胺A带（反映N—H的伸缩振动）、酰胺I带和酰胺II带的峰值下降及峰位均发生红移或蓝移；这意味着氢键和疏水相互作用参与C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的过程，并可能引起了蛋白质二级结构发生变化。此外，大豆蛋白还可以与C3G中的芳香环之间形成疏水相互作用。因此，大豆蛋白和C3G之间的氢键与疏水相互作用，可能被认为是促进两者结合的主要作用力；并进一步影响了蛋白质的二级结构的变化。

CD光谱分析

如图7和表4所示，C3G的加入使大豆蛋白二级结构产生微小变化，即α-螺旋相对含量降低，β-折叠相对含量提高；而β-转角和无规卷曲相对含量则无明显变化。这暗示C3G可能结合到大豆蛋白α-螺旋结构的疏水区域，诱导其向β-折叠转变，使肽链轻微解折叠。稳定的构象可能会对C3G的稳态化起到良好作用，与C3G混合后，蛋白质α-螺旋含量降低和β-折叠含量增加可以提高C3G的稳定性。因此，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能有望成为保护、递送C3G的优良载体。

分子对接分析

选取黑米花青素中含量最高的C3G为模型多酚，进行分子对接。随后从50种对接结果中选出结合能前5的对接姿态进行展示（表5），并遵循最小能量原则选出最优结果（图8），进行对接细节分析。从结合能而言，ΔG的数值表明C3G均自发与两种蛋白结合，且与大豆球蛋白的结合程度更大，在大豆球蛋白-C3G体系中表明该复合物更稳定。该结果表明，与β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白-C3G体系的组合降低了生物体内小分子的利用度。小分子的生理活性及其在体内的功能与载体蛋白的亲和力有关，因此推测大豆球蛋白对C3G的运输能力可能要比β-伴大豆球蛋白强。此外，在所有分子间作用力中以Evhd为主，表明范德华力、氢键和疏水作用力是两者结合过程中的主要作用力；静电作用力数值极小，表明其不是主要作用力，但对维持构象稳定有一定的贡献。

图8B和C表明β-伴大豆球蛋白共有7个氨基酸残基参与了C3G的结合。其中疏水性氨基酸Asp-934、Ile-921、Lys-951和Arg-933的疏水部分与C3G距离较近，形成4个疏水相互作用，从而减少了水的介入，有助于C3G与β-伴大豆球蛋白形成稳定的复合物；Arg-918、Asp-934、Thr-948、Glu-950、Lys-951与C3G共形成10个氢键。与疏水相互作用类似，这些氢键也加强了非共价作用的强度，使二者结合更加稳固；此外，C3G中的二羟基苯环与Lys-951带正电的氨基形成π-阳离子作用力。

图8E和F显示大豆球蛋白共有6个氨基酸残基参与了C3G的结合。其中Arg-522、Val-523和Glu-533参与形成疏水相互作用；Arg-522、Val-523、Asp-531、Glu-533、Thr-537、Gly-542参与形成氢键，C3G的二羟基苯环与Arg-522具有正电性的胍基形成π-阳离子作用力。因此，在C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子对接过程中，疏水作用力起重要作用。并且，由于C3G是一种被广泛认同的良好氢供体，其与蛋白质基团形成的氢键对维持复合物稳定性也起决定性作用。此外，还兼具π-阳离子结合力的作用。不仅如此，大豆蛋白与C3G的芳香环结合，大部分酚羟基参与成键；因此β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能对C3G形成保护，进而提升C3G的稳定性。

结论

通过多重光谱技术及分子对接等手段研究了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白与C3G的相互作用，主要结论如下：1）C3G可以通过静态和动态兼具的猝灭方式猝灭的大豆蛋白内源荧光。C3G主要通过范德华力、氢键或疏水作用分别与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白形成复合物；2）C3G可以结合至大豆蛋白的疏水空腔中，依靠多种作用力共同维持复合物的稳定性；C3G诱导部分蛋白质二级结构α-螺旋向β-折叠转变，多肽链发生解折叠。此外，还引起了β-伴大豆球蛋白的Try残基微环境的变化；3）C3G与大豆球蛋白的亲和力强于β-伴大豆球蛋白。C3G与大豆蛋白的结合可能有利于C3G的递送，但一定程度上减弱C3G的利用度和生理活性。

作者简介

第一作者

黄国，东北农业大学食品学院2019级硕士研究生。研究方向：大豆蛋白高值化利用。

通信作者

隋晓楠，东北农业大学食品学院教授，博士生导师，粮食工程系副主任，毕业于新加坡国立大学（NUS）获博士学位。主要从事大豆球蛋白分子结构解析、构效关系表征、调控机制等相关研究。研究成果以第一或通信作者在Annu. Rev. Food Sci. Tech.、Trends Food Sci. Technol.、Biomaterials、Food Hydrocolloids等国际Top期刊上发表SCI论文40余篇。国家自然科学基金-优秀青年科学基金、国家人社部“高层次留学人才”、国家教育部“霍英东青年教师”基金、中国科协“青年人才托举”工程项目资助者，黑龙江省青年“龙江学者”和黑龙江省“头雁计划”成员，荣获黑龙江省“青年五四”奖章。曾先后获得黑龙江省自然科学一等奖、黑龙江省高等学校自然科学一等奖等奖项。并担任期刊《未来食品科学》编委、SCI期刊Molecules编委、J. Food Biochem.编委和J. Texture Stud.客座主编。

本文《矢车菊素-3-葡萄糖苷与大豆蛋白相互作用的多重光谱分析及分子对接》来源于《食品科学》2022年43卷22期24-33页，作者：黄国，陈骐，池云峰，罗小雪，衣艳娇，王迪，隋晓楠*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220113-131。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。