食品界

华南农业大学周爱梅教授等：基于酶活力和细胞模型分析广佛手多糖降血糖活性及作用机制

糖尿病是一种以高血糖浓度为特征的代谢性疾病，会伴随许多并发症，临床一般采用注射胰岛素和口服降糖药进行治疗。为了避免药物带来的不良反应，一些具有降血糖作用的天然活性物质成为了研究热点。其中多糖的降血糖作用得到广泛的研究，如灵芝多糖、麦冬多糖和黄芪多糖等都表现出良好的降血糖效果。

佛手多糖是佛手中主要活性组分之一，具有抗氧化、免疫、抗衰老抗肿瘤等生物活性，但目前鲜见佛手多糖降血糖活性的研究，其作用机制也尚不明确。

华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室的杨玉洁、周爱梅*等通过测定广佛手多糖各分离纯化组分对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和ACE的抑制效果，并利用3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，测定细胞糖代谢、脂代谢、肿瘤坏死因子（TNF）-α分泌量，初步评价和筛选出降血糖活性较高组分FCP-2-1，分析FCP-2-1对PI3K/AKT通路蛋白表达的影响，以期为广佛手精深加工及其在健康食品领域中的应用提供参考。

1、广佛手多糖对相关酶活力的体外抑制能力

广佛手多糖对α-葡萄糖苷酶活力抑制能力

取广佛手多糖FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1和阿卡波糖（阳性对照）分别用PBS配制成不同质量浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的多糖溶液；采用PBS分别配制7.5 mmol/L PNPG溶液与0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液。采用96 孔板反应体系，分别取50 μL多糖溶液加入孔板中，每孔加入100 μL α-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃下温孵10 min后加入50 μL PNPG溶液，37 ℃反应25 min后，测定405 nm波长处吸光度A1。以等体积PBS取代多糖溶液，测定吸光度A0；以等体积PBS取代α-葡萄糖苷酶溶液，测定吸光度A2。

如图1所示，各组分广佛手多糖的α-葡萄糖苷酶活力抑制率随质量浓度的升高而增加，呈剂量-效应关系。4.00 mg/mL FCP-2-1对α-葡萄糖苷酶活力抑制能力最强，抑制率为65.66%，是相同质量浓度阿卡波糖抑制率的75.04%。FCP-2-1对α-葡萄糖苷酶活力的IC₅₀为2.74 mg/mL。FCP-2抑制能力其次，最高抑制率为49.76%，IC₅₀为7.25 mg/mL。FCP-1和FCP抑制能力最差，最高抑制率分别为28.71%和15.18%，IC₅₀分别为16.71、17.01 mg/mL。通过比较IC₅₀可知，FCP-2-1对α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力达到FCP的6.23 倍，FCP-2对α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力达到FCP-1的3.96 倍。

广佛手多糖对α-淀粉酶活力抑制能力

采用PBS分别配制质量分数5%可溶性淀粉溶液与2 U/mL α-淀粉酶溶液。参考赵凯等的方法配制DNS试剂。向各试管中分别加入300 μL 不同质量浓度的多糖溶液及400 μL α-淀粉酶溶液，混合均匀后于37 ℃下温孵10 min，随后分别加入300 μL可溶性淀粉溶液并在37 ℃反应15 min。最后分别加入2 mL DNS试剂显色，并立即煮沸10 min以终止反应；冷却后将混合体系用PBS定容至10 mL，测定其540 nm波长处吸光度A1。以等体积PBS取代多糖溶液，测定其540 nm波长处吸光度A0；以等体积PBS取代α-淀粉酶溶液，测定其540 nm波长处吸光度A2。

如图2所示，各组分广佛手多糖的α-淀粉酶活力抑制率随质量浓度的升高而增加，呈剂量-效应关系。当质量浓度为4.00 mg/mL时，各组抑制率达到最高，FCP-1和FCP抑制率较低，分别为42.44%和37.91%，IC₅₀分别为6.60、11.77 mg/mL；FCP-2抑制能力较强，最高抑制率为49.15%，IC₅₀为1.37 mg/mL；FCP-2-1抑制α-淀粉酶活力的能力最强，抑制率为74.20%，IC₅₀为0.87 mg/mL，其抑制率是阳性对照阿卡波糖的74.95%。由IC₅₀可知，FCP-2-1对α-淀粉酶活力的抑制能力达到FCP的13.53 倍，FCP-2对α-淀粉酶活力的抑制能力达到FCP-1的4.82 倍。与α-葡萄糖苷酶类似，α-淀粉酶的活力也可影响餐后血糖浓度，因为二者都是消化吸收的关键酶，可水解食物中的糖类物质产生葡萄糖。

广佛手多糖对ACE活力抑制能力

以PBS为溶剂分别配制不同质量浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的广佛手多糖溶液和卡托普利溶液（阳性对照）；采用pH 8.3、0.1 mol/L磷酸-硼砂缓冲液分别配制0.1 U/mL ACE溶液与2.5 mmol/L HHL溶液。取10 μL ACE溶液分别与40 μL不同质量浓度的广佛手多糖溶液、卡托普利溶液混合，并在37 ℃孵育5 min，然后加入150 μL HHL溶液启动反应，37 ℃孵育30 min，最后加入200 μL 1.0 mol/L HCl溶液终止反应。反应溶液经0.25 μm水系针式过滤器过滤后采用LC-10ATVP plus高效液相色谱仪进行分析。

如图3所示，各组分广佛手多糖的ACE抑制率也呈剂量-效应关系。4.00 mg/mL FCP-2-1、FCP-2、FCP-1、FCP溶液的ACE抑制率依次为88.02%、86.86%、66.71%、85.24%，其IC₅₀依次为0.85、1.03、1.89、1.09 mg/mL。比较IC₅₀可知，FCP-2-1对ACE的抑制能力是FCP-1的2.22 倍；FCP-2对ACE的抑制能力是FCP-1的1.83 倍。ACE活力抑制实验常用于评价物质的降血压活性，同时，ACE活力也与II型糖尿病及其并发症的发展密切相关，对于ACE抑制剂类药物的运用有助于降低心脑血管及肾脏疾病患者II型糖尿病的发病率。

2、3T3-L1胰岛素抵抗模型建立

正常形态的3T3-L1前脂肪细胞呈梭状（图4A），经过诱导分化后，细胞形态发生明显改变，细胞体积变大，边缘圆润，呈典型的戒环状，油红O染色观察结果中脂滴呈橙红色（图4B）。经100 nmol/L胰岛素刺激后，成熟脂肪细胞培养液中葡萄糖质量浓度极显著高于空白对照正常3T3-L1前脂肪细胞（P＜0.01），和胰岛素刺激前的正常3T3-L1前脂肪细胞没有显著差异（P＞0.05）（图4C），说明细胞对胰岛素刺激产生抵抗，不能及时将葡萄糖转运至细胞内。由此可知，胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞模型建立成功。

3、广佛手多糖对3T3-L1脂肪细胞存活率的影响

如图5所示，与空白组相比，在作用时间24 h、广佛手多糖作用质量浓度为0.2～2 000 μg/mL时，3T3-L1脂肪细胞的存活率最大增加了10.92%。FCP-1、FCP-2和FCP-2-1在高质量浓度时对细胞的生长表现出抑制作用，当作用时间24 h、质量浓度2 000 μg/mL时，FCP-1、FCP-2和FCP-2-1组细胞存活率分别为68.25%、92.60%、71.57%。并且这种抑制作用随着作用时间的延长而加强，当作用时间72 h、质量浓度2 000 μg/mL时，FCP-2和FCP-2-1组的细胞存活率分别仅为46.91%和50.91%。因此，4种广佛手多糖的作用时间应不超过48 h、质量浓度为0.2～200 μg/mL。

4、广佛手多糖对3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响

如图6所示，胰岛素抵抗细胞经胰岛素刺激后，细胞培养液中葡萄糖质量浓度极显著下降（P＜0.01）。经不同质量浓度广佛多糖组分处理后，与阴性对照组相比，各组葡萄糖质量浓度均极显著降低（P＜0.01），最高下降了45.06%。其中，不同质量浓度的FCP-2-1干预后，细胞培养液中葡萄糖质量浓度较胰岛素组均极显著下降（P＜0.01），最高下降了31.90%，同时与其他相同质量浓度的广佛手多糖组分相比也具有显著差异（P＜0.05），说明FCP-2-1促进细胞葡萄糖转运的效率最高。

5、广佛手多糖对3T3-L1脂肪细胞TNF-α分泌量的影响

如图7所示，各质量浓度的FCP-2-1和二甲双胍均可以显著降低胰岛素抵抗细胞上清的TNF-α质量浓度（P＜0.01）。其中，FCP-2-1能有效抑制TNF-α分泌，且呈剂量-效应关系。150 μg/mL FCP-2-1处理后TNF-α质量浓度相比阴性对照组下降了67.09%，相比二甲双胍组下降了50.06%。50、150 μg/mL的FCP-2和150 μg/mL的FCP-1也能显著抑制TNF-α的分泌（P＜0.05），与阴性对照组相比分别下降了38.53%、48.53%和40.88%。

6、广佛手多糖对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响

如图8所示，不同质量浓度广佛手多糖各组分均能极显著降低3T3-L1脂肪细胞TG、LDL-C浓度（P＜0.01），极显著提高HDL-C浓度（P＜0.01）。相比阴性对照组，FCP-2-1降低了细胞TC、TG和LDL-C分泌量，分别最高可降低35.68%、65.37%和46.42%，HDL-C分泌量最高可提高444%。与二甲双胍组相比，不同质量浓度FCP-2-1抑制TG分泌的效果更好，在作用质量浓度为150 μg/mL时，FCP-2-1组TG浓度为阴性对照组的32.68%。其中FCP和FCP-2-1处理组随质量浓度的增加，TC浓度呈下降趋势。

7、广佛手多糖对3T3-L1脂肪细胞PI3K/AKT相关通路蛋白表达的影响

结果如图9所示。相比于阴性对照组，二甲双胍和不同质量浓度FCP-2-1均能使3T3-L1脂肪细胞中PI3K、GLUT4、AKT和p-AKT蛋白相对表达水平极显著增高（P＜0.01），其中FCP-2-1质量浓度与AKT磷酸化水平呈剂量-效应关系。50 μg/mL FCP-2-1促进PI3K蛋白表达的效果极显著优于二甲双胍（P＜0.01），相比提高了157.14%。50 μg/mL FCP-2-1促进GLUT4和p-AKT表达的效果也显著优于二甲双胍（P＜0.05），促进率分别提高了38.46%和26.67%。

结论

综上所述，FCP-2-1可通过抑制相关酶活力和改善糖、脂代谢发挥其降血糖活性，其机制可能是FCP-2-1激活了葡萄糖转运重要通路PI3K/AKT中相关蛋白的表达。

本文《基于酶活力和细胞模型分析广佛手多糖降血糖活性及作用机制》来源于《食品科学》2022年43卷23期149-157页，作者：杨玉洁，刘焕，王淑惠，柳春红，陈树喜，周爱梅。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220104-024。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。