Introduction

食物过敏是由食物过敏原引起的IgE介导的免疫紊乱，是影响食品安全的重要因素之一。许多日常食物中都含有过敏原，如牛奶、大豆、鸡蛋、花生、坚果、小麦、鱼类和贝类等。人为添加的或在食物加工过程中混入的过敏原都可能引起过敏反应。据统计5%的成年人和8%的青少年在吸入或摄入过敏性食物成分时会发生食物过敏，食物过敏已成为影响过敏性消费者健康的重大风险。

牛奶因其富含蛋白质、脂肪和矿物质，在人们日常饮食中发挥着很大作用。同时，牛奶是最常见的食物过敏原之一，尤其是对婴幼儿。牛奶中的过敏原蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白、免疫球蛋白和牛血清白蛋白。鸡蛋富含膳食蛋白质，也是我们日常饮食最常见的食物，然而蛋清中含有卵白蛋白等过敏原。对于消费者来说，避免食物过敏的最好方法就是远离过敏性食物。为保护消费者，许多国家制定了食品标签法，在一些特定产品标签上有“不含牛奶”或“不含鸡蛋”等说明。在欧洲，当食物中含有14种过敏原成分时，必须在食品标签上注明，这些过敏原包括牛奶、花生、鸡蛋、大豆、鱼、甲壳类动物、含有麸质的谷物、坚果、芹菜、羽扇豆、芥末、芝麻、软体动物和二氧化硫。

食物中过敏原的检测方法有免疫化学法、酶联免疫吸附法（ELISA）、凝胶电泳法（GE）、毛细管电泳法（CE）、序列特异性DNA法、液相色谱法等。然而，免疫化学法和ELISA可能会受到交叉反应的影响，导致假阳性结果。GE和CE方法相对快速，适合常规筛查，但它们不适合蛋白质鉴定。高效液相色谱法是蛋白质测定的一种相对成熟的方法，但当分析物浓度较低时，其分辨率和灵敏度通常不足。近年来，质谱技术以其高灵敏度和高准确度已成功用于食品中过敏原的检测，高效液相色谱或纳升级液相色谱串联质谱已用于测定消化后的完整蛋白质或特征肽段。

河北省食品检验研究院范素芳博士、张岩研究员等建立了液相色谱-串联质谱法测定食品中的牛奶过敏原和鸡蛋过敏原。该团队鉴定并合成了卵白蛋白（OVA）、α-乳清蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-La）、α_S1酪蛋白（α_S1-CN）和α_S2酪蛋白（α_S2-CN）的特征肽段，同时合成了同位素标记的特征肽段，用于食品中鸡蛋和牛奶过敏原蛋白的检测。

OVA、α-La、β-La、酪蛋白用胰蛋白酶酶解后，用纳升液相色谱系统分离肽片段，并用Q Exactive高分辨质谱分析。使用Thermo Proteome Discoveryr 1.4软件分析Q Exactive的原始数据，OVA共鉴定出13个肽段，特征肽段序列覆盖率为49.5%；α-La共鉴定出11个肽段，特征肽段序列覆盖率为48.8%；β-La共鉴定出8个肽段，特征肽段序列覆盖率为40.4%；α_S1-CN共鉴定出12个肽段，特征肽段序列覆盖率为51.9%；α_S2-CN共鉴定出13个肽段，特征肽段序列覆盖率为56.3%。根据特征肽的选择原则（没有缺失的裂解位点，不含容易被修饰的氨基酸，具有适当的肽段长度和良好的质谱响应，对所选蛋白质具有唯一性），共选出13个肽特征肽段，其中OVA 特征肽段3个，分别为LTEWTSSNVMEER(LR-13)，GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)， 和 ELINSWVESQTNGIIR(ER-16)；α-La特征肽段2个，分别为VGINYWLAHK (VK-10) 和 LDQWLCEKL (LL-9)；β-La特征肽段2个，分别为VLVLDTDYK (VK-9)，TPEVDDEALEK (TK-11)；α_S1-CN特征肽段3个，分别为FFVAPFPEVFGK (FK-12)， HQGLPQEVLNENLLR (HR-15)， YLGYLEQLLR (YR-10)；α_S2-CN特征肽段3个，分别为NAVPITPTLNR(NR-11), FALPQYLK(FK-8), TVYQHQK (TK-7)。最终选择GR-16、VK-10、VK-9、FK-12和NR-11作为OVA、α-La、β-La、α_S1-CN和α_S2-CN作为定量肽段。

图1 OVA, α-La, β-La, α_S1-CN和α_S2-CN的氨基酸序列，加粗的为Q Exactive质谱鉴定的肽段，带下划线的为特征肽段

内标法是减少LC-MS/MS基质效应的有效方法之一，本方法中我们合成了同位素标记的肽段作为内标。OVA的同位素内标为GGL*EPINFQTAADQAR（¹³C₆¹⁵N），α-La的同位素内标为V*GINYWLAHK（¹³C₅¹⁵N），β-La的同位素内标为VL*VLDTDYK（¹³C₆¹⁵N），α_S1-CN的同位素内标为FFV*APFPEVFGK（¹³C₅¹⁵N），α_S2-CN的同位素内标为NAV*PITPTLNR（¹³C₅¹⁵N），其中亮氨酸（L）和缬氨酸（V）残基中的所有碳原子和氮原子都用¹³C和¹⁵N标记。众所周知，在许多情况下，氘化物质的合成更容易、成本更低，但与骨架中的¹³C和¹⁵N相比，当氘原子存在于氨基酸或其他可交换氢原子的酸性侧链中时，它们容易断裂和丢失。

图2 分析物的提取离子色谱图

方法特异性。为了确定该方法的特异性，将肽段标准品的色谱图与加有内标物的相应胰蛋白酶样品进行比较。合成的肽段标准品和经胰蛋白酶酶解的样品在相同的保留时间内均出现一个尖锐且对称的峰，未经胰蛋白酶酶解的样品中没有峰。此外，结果还表明样品基质成分对特征肽段的保留时间没有干扰。

方法的线性范围，检出限（LOD）和定量限（LOQ）。采用不含牛奶和鸡蛋成分的面包、蛋糕、饼干、米皮和小麦粉进行方法验证，以分析物浓度为横坐标（x），以分析物响应与内标物响应之比为纵坐标(y)拟合标准曲线，采用内标法定量。采用标准添加的方式计算方法的检出限和定量限，信号/噪声分别为3和10时添加浓度为方法的检出限和定量限。OVA的LOD范围为17.71~35.43 mg/100 g，LOQ范围为53.14~70.86 mg/100 g；α-La的LOD范围为28.36~56.71 mg/100 g，LOQ范围为70.89~141.78 mg/100 g；β-La的LOD范围为7.70~19.25 mg/100 g，LOQ范围为30.80~53.90 mg/100 g；α_S1-CN的LOD范围为0.94~14.17 mg/100 g，LOQ范围为2.36~33.06 mg/100 g；α_S2-CN的LOD范围为2.52~10.09 mg/100 g，LOQ范围为10.09~30.27 mg/100 g。

方法的基质效应。本方法中用基质匹配的标准溶液和溶剂配制的标准溶液绘制的标准曲线斜率之比表示方法的基质效应。OVA 的基质效应范围95.05%~113.7%，α-La的基质效应范围 90.42%~128.1%，β-La 的基质效应范围100.4%~119.8%，α_S1-CN的基质效应范围 82.17%~102.3%，α_S2-CN 的基质效应范围106.1%~123.0%。

方法的准确度和精密度。OVA添加水平1.77， 5.31 和 10.63 mg/g时，方法的回收率范围76.7%~109.6%；α-La添加水平1.42， 2.13 和 2.84 mg/g，方法的回收率范围85.8%~109.0%；β-La添加水平1.54， 4.62 和 9.24 mg/g，方法的回收率范围87.1%~122.8%；α_S1-CN添加水平0.94, 2.83 和 5.67 mg/g，方法的回收率范围83.6%~119.6%；α_S2-CN添加水平1.01, 3.03和6.05 mg/g，方法的回收率范围90.0%~118.4%。

为了考察该方法的适用性，从当地超市购买了30 个样品。在柠檬三明治曲奇、巧克力派、沙奇玛、覆盆子面包、士力克、水果面包、法国软面包和粉丝样品中检测到OVA，浓度范围为（97.07±8.49） mg/100 g至（338.10 ± 14.89）mg/100 g。11 个样品中检出α-La，浓度范围为（31.34±2.86）mg/100 g 至 （577.21±34.02）mg/100 g；23个样品中检出β-La，浓度范围为（71.15±1.54）mg/100 g 至（5 197.23±70.04）mg/100 g；24 个样品中检出α_S1-CN，浓度范围为（49.17±0.35）mg/100 g 至 （4 634.64±99.77）mg/100 g；24 个样品中检出α_S2-CN，浓度范围为（29.98±0.51）mg/100 g至（1 598.91±107.51）mg/100 g。

本实验建立了一种新的液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中的卵白蛋白和牛奶中的α-La、β-La、α_S1-CN、α_S2-CN等食物过敏原。GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）、VGINYWLAHK（VK-10）、VLVLDTDYK（VK-9）、FFVAPFPEVFGK（FK-12）、NAVPITPTLNR（NR-11）选为OVA、α-La、β-La、α_S1-CN和α_S2-CN的定量肽段，合成特征肽段及同位素标记的肽段用于方法的定量分析。对该方法的特异性、线性范围、基质效应、准确度和精密度进行了考察，该方法已成功用于各种食品样品中鸡蛋和牛奶过敏原的检测。

第一作者简介

范素芳，女，理学博士，高级工程师，河北省青年拔尖人才，河北省“三三三人才工程”二层次人才，主要从事食品中风险物质检测技术开发，食品安全与质量分析等方面的研究。主持、参与省部级以上科研项目10余项，科研成果获省部级科研奖励11项，在国内外期刊公开发表学术论文40余篇。

通信作者简介

张岩，男，研究员，医学博士后，河北省食品检验研究院副院长，享受国务院特殊津贴专家，河北省“三三三”人才工程第一层次人选，河北省青年拔尖人才，国际标准化组织生物技术委员会生物分析方法工作组专家，第二届食品安全国家标准审评委员会委员。主持国家级项目6项，在Acta Pharmaceutica Sinica B等期刊发表SCI论文70余篇，参编出版专著24部，授权国家发明专利9项，登记计算机软件著作权8项；制修订国家标准54项、行业标准11项、地方标准65项，科研成果获省部级科技进步奖25项。