J. Future Foods | 一株来源于生榨米粉的降嘌呤乳酸菌全基因组分析—或含有完整嘌呤代谢

Introduction

在中国，高尿酸血症已成为仅次于糖尿病的第二大代谢疾病，其中约10%会发展为痛风。流行病学研究发现，高尿酸血症与高血压、肥胖、肾病、心血管疾病和糖尿病的发展有关。同时，一些研究也证实，痛风和高尿酸血症与严重的心脏代谢和肾脏并发症有关，导致痛风患者早期死亡率持续增加。

目前，最常用的治疗和预防痛风的方法可分为两类：药物治疗和食物治疗。但都有一定程度的负面作用，这就需要通过嘌呤降解细菌或酶专门降低高嘌呤食品中的嘌呤含量来制造低嘌呤食物。已有研究证明了可以通过使用嘌呤降解酶（包括黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶）生产低嘌呤含量的食品。然而鲜少有关于降嘌呤菌株的研究报道，尤其是乳酸菌，并且了解，暂时没有关于降嘌呤菌株基因组的相关分析。

目前，大多数降嘌呤乳酸菌的功能鉴定仅限于嘌呤代谢途径上游基因的表征——这只能证实它们具有降解肌苷和鸟嘌呤的能力，而没有对与黄嘌呤和尿酸降解相关的下游基因进行相关表征。本研究筛选的发酵乳杆菌9-4（L. fermentum 9-4）对嘌呤降解中的许多代谢过程都进行了相关功能验证。

通过提取粗酶溶液并使用HPLC，测定了嘌呤代谢途径的中多个代谢过程的相关酶活性。结果表明，粗酶溶液不仅对肌苷、鸟苷等有较强的降解能力，对于黄嘌呤和尿酸也有较强的分解能力。这意味着L. fermentum 9-4可能具有完整的嘌呤代谢途径，能够将嘌呤物质降解为尿酸，然后进一步降解为尿囊素，填补了目前发现的降嘌呤乳酸菌代谢途径的空白。

本实验室从中国广西壮族自治区特色食品生榨米粉中分离出来的L. fermentum 9-4是一种新的降嘌呤益生菌。体外实验表明，L. fermentum 9-4可以有效降低食物中的嘌呤含量，具有良好的嘌呤核苷同化和嘌呤代谢酶活性。在本研究中，对L. fermentum 9-4的全基因组进行了测序和分析。结合分子生物学实验，可以为进一步理解嘌呤降解机制提供理论指导。

Results and Discussio

L. fermentum 9-4 的全基因组

L. fermentum 9-4的基因组是无质粒的基因组，具有单个2085632 bp的环状染色体。该染色体的GC含量为51.25%，基因组包含2089个预测编码序列（CDs）、5、5、5个rRNA基因（5S、16S、23S）和59个tRNA编码基因。

注释COG基因的类别由圆形表示中的颜色代码识别（图1）。共有1907个COG基因分为4类和25个功能组（图1）。COG分析将“information storage and processing”和“metabolism”列为染色体上最丰富的两个功能类别，分别占31.58%和29.30%。在前者中，527个蛋白质被分为3个COG功能组，其中“replication, recombination and repair”是最丰富的一个。“metabolism”中的490个蛋白质被分为8个COG功能组，其中最丰富的为“amino acid transport and metabolism”（COG initial E，9.49%）。

图1 L. fermentum 9-4的圆形地图

抗生素抗性基因

其抗性基因只有1个，为具有杆菌肽抗性的十一烯基焦磷酸磷酸酶（表1）。这可能与生榨米粉的生产过程有关。生榨米粉以新鲜无虫蛀的籼米为原料，经发酵、打浆、压团、打团、榨粉工艺制成，且为现吃现榨，制作过程未添加防腐剂或其他添加剂。

表1 在L. fermentum 9-4中发现抗生素耐药基因

嘌呤降解能力

先前的工作表明，L. fermentum 9-4可以有效降低食物中的嘌呤含量，具有良好的嘌呤核苷同化和嘌呤代谢酶活性。肌苷和鸟苷的降解率分别为88.6%和92.8%，总核苷降解率为90%。这些结果与L. fermentum 9-4全基因组序列中揭示的核苷（肌苷和鸟苷）代谢途径的存在非常一致（图2）。值得注意的是，L. fermentum 9-4的基因组核苷酸代谢途径比其他先前报道的发酵乳杆菌菌株更完整，这可能对降低食物中肌苷和鸟苷的嘌呤性能更有利。结合其对酸和胆盐的更好耐受性，L. fermentum 9-4必将更有利于低嘌呤发酵产品的制备和在人体内的利用。

图2 L. fermentum 9-4与其他菌株嘌呤代谢途径相关基因的比较

然而，其基因组中并没有编码黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶的基因，它们能够将次黄嘌呤降解到黄嘌呤再到尿囊素。这两种基因的缺失明显偏离了我们的实验结果——该菌株显示出明显的黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶活性，并代谢了食物中次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸。这预示着L. fermentum 9-4可能含有前所未有的新酶，能够将嘌呤类物质最终降解成尿囊素。

毒性因子

为了促进L. fermentum 9-4的工业应用，有必要评估其潜在毒性。对VFDB进行BLAST分析，以确定L. fermentum 9-4中的潜在毒力基因（positive matching criteria：＞40% identity，E＜10⁻⁵）。在基因组中，鉴定了24种毒性因子（表2）。NCBI基因数据库的BLAST搜索表明，毒力因子VFG001206在其他发酵乳杆菌菌株中没有出现，但广泛存在于副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中，结果表明其功能与GE00500序列表达的蛋白质相似，即铁（Ⅲ）ABC转运蛋白。GE00500序列也广泛存在于其他发酵乳杆菌菌株中。

表2 L. fermentum 9-4中鉴定的毒力因子

其他毒力相关基因广泛存在于其他发酵乳杆菌的全基因组中，包括F-6、3872、CECT5716、MTC8711、28-3-CHN等。目前，还没有关于发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌作为益生菌的安全问题的报道。因此，L. fermentum 9-4可以排除潜在安全问题。

全基因组系统发育树的构建

为了评估L. fermentum 9-4与其他乳杆菌之间的进化距离，通过比对20种不同的乳杆菌菌株（包括L. fermentum 9-4）构建了16S rRNA序列系统发育树。如图所示（图3），在进化中，L. fermentum 9-4与乳杆菌密切相关，尤其是发酵乳杆菌7002和发酵乳杆菌6588，亲缘相似性为94%。

图3 20株乳酸菌的系统发育树

L. fermentum 9-4降嘌呤能力的鉴定

将次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、肌苷、鸟苷和尿囊素添加到粗酶溶液中作为底物，商业化的黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶用作阳性对照，通过HPLC检测每种物质的含量。结果表明，体系中的黄嘌呤和尿酸部分降解，表明黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶或这两种酶的同工酶存在于粗酶溶液中（表3）。

表3 酶活性、总蛋白含量和比酶活性结果

Conclusion

本研究首次对降嘌呤的L. fermentum 9-4全基因组进行了测序。其基因组由一条2085632 bp的环形染色体组成，无质粒，GC含量为51.25%。共有2089个CD、15个rRNA操纵子和59个tRNA编码基因被注释，具有比其他乳杆菌更完整的核苷酸降解途径。在L. fermentum 9-4中，除了一个具有杆菌肽抗性的十一碳烯基焦磷酸磷酸酶外，没有其他抗性基因。且只预测到24个常见于乳酸杆菌菌株的毒性因子，但没有发现具有毒性的毒性因子。这一结果可能是L. fermentum 9-4优异的嘌呤核苷同化和嘌呤代谢酶活性的基础，并表明其作为低嘌呤食物的嘌呤降解益生菌具有良好的潜在应用前景。未来的工作可能会在实验上挖掘相应的嘌呤水解酶，并完成L. fermentum 9-4从嘌呤到尿囊素的整个嘌呤代谢途径的功能注释。

第一作者

高田田，女，工学硕士在读。本科就读于苏州大学医学部食品质量与安全专业，后于广西大学攻读食品科学与工程硕士学位。主要研究方向为全细胞生物传感器的建立与性能优化。曾主持完成《苏州大学第二十批大学生课外学术科研基金》个人项目，顺利结项并考核优秀。

通信作者

王成华 副教授，博士生导师，南宁市特聘专家。广西大学轻工与食品工程学院。2013年12月获得南京工业大学工业生物催化专业博士学位，2014年1月-2016年12月在清华大学化学工程系完成博士后训练，2017年1月迄今在广西大学轻工与食品工程学院食品系工作。主要面向大健康产业和痛风等代谢综合症人群的营养功能健康食品需求，开展特色食品资源功能因子挖掘、食品生物催化剂创制、降尿酸技术、硒合成生物技术研究。先后主持国家自然科学基金面上项目、青年科学基金项目、中国博士后科学基金特别资助项目以及广西科技基地与人才专项项目等多项，参与完成国家自然科学基金重大仪器专项和广西创新驱动重大专项等项目。申请18项发明专利（授权11项），在Food Chemistry、Bioresource Technology和食品科学等国内外重要学术期刊上发表学术论文40多篇，其中SCI收录论文30多篇。曾指导学生荣获中国食品科学技术学会“第三届安琪酵母杯大学生创新食品竞赛”第一名，荣获2015年中国酶工程与糖生物工程学术研讨会“优秀青年报告奖”，受邀在“第三届食品科学与人类健康国际研讨会”报告，参与完成2018年度广西科技进步奖二等奖1项。国家自然科学基金项目评审专家，第六批南宁市特聘专家，Journal of Future Foods编委，Food Chemistry、Food Science and Human Wellness等期刊评审专家。

**Complete genome sequence of Lactobacillus fermentum 9-4, a purine-degrading Lactobacillus probiotic isolated from Chinese fermented rice-flour noodles**

Tiantian Gao, Lianghua Lu, Qingling Wu, Chenghua Wang*

College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China

*Corresponding author.

Abstract

Lactobacillus fermentum 9-4 is a purine-degrading probiotic firstly isolated from traditional fermented rice-flour noodles with special characteristics of southern China's Guangxi Zhuang Autonomous Region. L. fermentum 9-4 could efficiently reduce the purine contents in foods with excellent purine-nucleoside assimilation and purine-metabolizing enzymatic activities. Crude cell lysate of L. fermentum 9-4 showed strong purine degradation abilities on nucleosides including inosine, guanosine, and purines including xanthine and uric acid, indicating a complete purine metabolic pathway to degrade purine substances to allantoin. In this study, the whole genome of L. fermentum 9-4 was sequenced. Its genome consisted of a 2085632 bp circular chromosome without plasmid. The GC content of circular chromosome was 51.25%, including 2089 coding sequences (CDs), 15 rRNA operons and 59 tRNA coding genes. Genetic analysis showed that at least 5 protein coding genes were related to purine lowering ability. In addition, neither toxic virulence factor nor drug resistance gene was identified by searching the virulence factor database and drug resistance gene database, suggesting good safety of L. fermentum 9-4. The results showed that L. fermentum 9-4 has a good potential for the development and utilization as a purine-degrading probiotic for low-purine foods.

Reference:

GAO T T, LU L H, WU Q L, et al. Complete genome sequence of Lactobacillus fermentum 9-4, a purine-degrading Lactobacillus probiotic isolated from Chinese fermented rice-flour noodles[J]. Journal of Future Foods, 2023, 3(2): 169-174. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.12.008.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅