食品界

野生粉杨梅游离酚提取物诱导MDA-MB-231癌细胞发生线粒体依赖性凋亡和G0/G1细胞周期阻滞

Introduction

在世界范围内，最常见的癌症之一是乳腺癌；它在癌症死亡中排名第五，是女性癌症死亡的主要原因。其中三阴性乳腺癌与其它亚型不同，它没有既定的治疗靶点，从而加大了治疗难度。鉴于药物的副作用和患者遭受的巨大痛苦，迫切需要开发新的治疗方法。

近30%的癌症是由饮食引起的，这表明改变饮食，如增加水果摄入，是减少癌症或其它严重疾病发生的有效途径。流行病学研究表明，水果摄入量增加与乳腺癌显著负相关。以植物为基础的食品，如水果，其生物活性植物化学成分含量很高，这可能是其在致癌的促进和发展阶段起抑制作用的原因。饮食中的植物化学物质已被证明是一种预防癌症的补充作用机制，如清除自由基、致癌物失活和缺失、修复DNA损伤、抑制细胞增殖、通过信号转导途径调节细胞周期、诱导细胞凋亡、抗血管生成和抗炎。

杨梅是一种重要的热带/亚热带植物，含有丰富的天然植物化学成分，同时，杨梅也具有很高的药用价值，因而受到广泛的关注。课题组前期对不同品种杨梅的生物活性进行了分析，发现野生粉杨梅含有更高的酚类物质和更强的抗氧化、抗增殖活性，然而，关于野生粉杨梅提取物对乳腺癌的抗增殖作用机制的研究报道较少。

本文拟探讨野生粉杨梅游离态多酚物质对MDA-MB-231细胞的抗增殖作用，通过评估p38 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt信号转导途径中涉及的蛋白质水平，以评估野生粉杨梅诱导MDA-MB-231癌细胞凋亡和细胞周期阻滞的能力。

Results and Discussion

野生粉杨梅提取物酚类化合物的特征

野生粉杨梅提取物的酚含量如图1A所示。总酚含量（TPC）为（490.17±8.04）mg GAE/100g FW。同时，游离组分（95.91%）显著高于结合组分（4.19%）。因此，在以下实验中使用了野生杨梅游离酚提取物（WPBFE）。根据之前的研究，通过与标准品进行比较，在WPBFE中共鉴定出八种酚类化合物（GA、PCOA、FA、PHA、PA、槲皮素、山奈酚和杨梅素）（图1B）。GA（（18.83±0.44）μg/g FW）和杨梅素（（1.52±0.05）μg/g FW）是WPBFE的主要酚类化合物。

图1 （A）自由酚、结合酚和总酚含量，（B）HPLC酚类组成分析

野生粉杨梅提取物对MDA-MB-231癌细胞的抗增殖活性

在图2A中，发现WPBFE以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖。对于WPBFE，EC₅₀值为（22.78±0.46）mg/mL，显著低于CC₅₀值（超过80 mg/mL）。这一结果表明，WPBFE的抗增殖活性不是由于细胞毒性，而是由于APA。WPBFE在剂量为20、40和60 mg/mL时的抑制率分别为49%、69%和81%，而在剂量低于60 mg/mL时没有细胞毒性。因此，将上述浓度用于进一步的研究。WPBFE的抑制作用≥60 mg/mL对MDA-MB-231细胞增殖的影响可能与WPBFE的细胞毒性有关。根据图2B，通过倒置显微镜观察这些浓度（0、20、40和60 mg/mL）的WPBFE的细胞数量。与对照组相比，经WPBFE处理的细胞变圆变钝，不能粘附在培养皿壁上，细胞数量显著减少，呈剂量依赖性。因此，WPBFE可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖。我们认为WPBFE含有大量酚类化合物，对MDA-MB-231细胞具有良好的抗增殖活性。

图2 （A）WPBFE对MDA-MB-231细胞增殖活性和毒性分析；（B）不同处理浓度下细胞的微观形貌

野生粉杨梅提取物诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡和周期阻滞

对于正常细胞生长，细胞增殖（分裂）和凋亡（程序性细胞死亡）之间存在平衡。细胞生长失控是肿瘤发生的关键，其主要特征是细胞增殖障碍和凋亡障碍。通过调控细胞周期和诱导细胞凋亡对癌细胞的异常增殖有一定的作用。因此，通过流式细胞术检测野生粉杨梅的游离态提取物（WPBFE）对MDA-MB-231细胞周期阻滞（图3A）和凋亡（图3B）的影响。

细胞周期是DNA损伤后细胞分裂、生长和增殖的重要调节器。它控制从细胞静止状态（G0）到增殖的转换，并通过检查点确保准确的基因转录。它是细胞繁殖的机制，通常分为四个阶段。G1和G2通过不同的长度间隔分离S期（DNA合成）和M期（有丝分裂）的周期。如图3所示，当MDA-MB-231细胞上的WPBFE浓度为20、40和60 mg/mL时，G0/G1（P＜0.05）细胞的数量呈剂量依赖性增加，从对照组的44.88%分别增加到48.79%、54.35%和60.25%（图3A）。然而，S期细胞比例（P＜0.05）以剂量依赖性的方式显著减少，分别从33.71%（对照组）降至30.84%、23.85%和18.34%。这一结果表明，WPBFE可阻滞MDA-MB-231细胞周期在G0/G1期。G1/S转换是细胞周期中调节DNA复制的关键检查点。随着细胞周期的进行，G1期阻滞导致细胞发生凋亡或修复机制。

细胞凋亡是细胞过程中非常重要的现象，与肿瘤的形成和发展有关。如图3B所示，WPBFE浓度为20、40和60 mg/mL时，总细胞凋亡百分比分别从6%（对照组）显著增加至8.85%、14.79%和16.68%。DNA损伤一般发生在G1/G2期，形成凋亡小体，造成细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关。此外，线粒体起始途径和细胞死亡受体（外源性）也可诱导癌细胞凋亡。综上所述，WPBFE可显著阻滞细胞周期于G0/G1期，诱导细胞凋亡，可能是抑制MDA-MB-231癌细胞增殖的重要因素。为了进一步阐明WPBFE对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抗增殖分子机制，在接下来的实验中，使用蛋白质印迹分析研究了参与周期阻滞和凋亡的蛋白质的表达情况，包括PCNA、Cyclin D1、CDK4、p21、p-p53、Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3。

图3 WPBFE对MDA-MB-231细胞周期和凋亡的影响

野生粉红杨梅提取物对MDA-MB-231癌细胞中参与细胞周期阻滞和凋亡的蛋白质水平的影响

在本实验中，PCNA的表达呈剂量依赖性下调（图4B）。与对照组相比（P＜0.05），在60 mg/mL剂量的WPBFE处理后，PCNA的表达被抑制了58.40%。细胞周期G1-S移位受到CyclinD1和CDK4这两个关键调节因子的影响。因此，我们检测了0、20、40和60 mg/mL剂量WPBFE处理的MDA-MB-231细胞中CDK4、CyclinD1和p21（CDK抑制剂）的表达。蛋白质印迹结果显示WPBFE显著降低促增殖蛋白的水平，包括MDA-MB-231细胞中的CDK4和CyclinD1，其中与对照组相比最大浓度下该蛋白表达水平分别降低了大约70%和60%（图4B）。此外，WPBFE处理后，抗增殖蛋白p21的表达显著增加，最大表达水平为对照组的2.56倍（图4B）。

为了检测WPBFE在MDA-MB-231癌细胞中的促凋亡作用模式，通过Western blot检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达。如图4B所示，WPBFE处理后，Bax蛋白表达略有增加，而Bcl-2表达显著降低。但是，WPBFE处理后的Bax/Bcl-2比率显著升高（在20、40和60 mg/mL浓度处理下分别为对照组的1.13倍、1.22倍和2.03倍）。此外，观察到WPBFE处理后cleaved caspase-3表达显著增加（P＜0.05），最大表达水平为对照组的1.29倍。因此，WPBFE可以通过调节周期相关蛋白将MDA-MB-231细胞周期阻滞在G0/G1期，并通过激活线粒体凋亡途径促进细胞凋亡。

图4 WPBFE对MDA-MB-231细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白的表达

野生粉红杨梅提取物可能通过调节的p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡和周期阻滞

图5B显示，与对照组相比，WPBFE显著上调MDA-MB-231细胞中的p-p53/p53表达（P＜0.05），在浓度为60 mg/mL时，最大表达水平为2.4倍。此外，p-p38/p38的表达以剂量依赖性方式显著增加，提示p-p38参与了WPBFE诱导的MDA-MB-231细胞的抗增殖活性。在浓度为60 mg/mL时，p-p38的表达水平比对照组高2.41倍（图5B，P＜0.05）。与对照组相比，WPBFE处理的MDA-MB-231细胞中的p-ASK1/ASK1表达以剂量依赖性方式显著增加，最大表达水平为4.29倍（图5B，P＜0.05）。然而，WPBFE显著下调TRAF2的表达，TRAF2是一种抗凋亡信号介质。浓度为60 mg/mL时，TRAF2表达水平最低，约为对照组的一半。研究还发现WPBFE处理降低了p-PI3K/PI3K以及p-Akt/Akt的水平（图5B，P＜0.05）。当剂量为60 mg/mL时，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的表达水平分别降低了85%和67%。因此，我们认为WPBFE通过p38 MAPK和PI3K/Akt途径抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，图6描述了WPBFE抗增殖作用的可能机制。

图5 WPBFE对MDA-MB-231细胞中p38 MAPK和PI3K/Akt通路相关蛋白的表达

图6 WPBFE通过p38 MAPK和PI3K/Akt信号转导通路调控MDA-MB-231细胞周期和凋亡的潜在作用机制

Conclusion

研究表明野生粉杨梅游离态提取物（WPBFE）对MDA-MB-231细胞有较好的抗增殖作用。进一步探究WPBFE对MDA-MB-231人乳腺癌细胞的抗增殖机理发现，WPBFE可通过p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路显著抑制细胞增殖并触发细胞凋亡。WPBFE抑制TRAF2表达，激活p-ASK1表达，然后导致磷酸化p38和p53表达水平升高。此外，WPBFE可下调MDA-MB-231细胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的表达，并使PI3K/Akt通路失活。在G0/G1细胞周期阻滞期，p53磷酸化增强并诱导p21表达，导致CDK4、CyclinD1和PCNA表达下调。在线粒体依赖性途径中，上调的p-p53导致Bax/Bcl-2比率升高，并诱导cleaved caspase-3激活，进而触发MDA-MB-231细胞凋亡。我们的结果为WPBFE作为具有抗肿瘤能力的生物活性化合物的潜在来源提供了一定的参考依据。

通信作者

龚二生，男，赣南医学院公共卫生与健康管理学院特聘教授，博士，硕士研究生导师。2018年博士毕业于南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，2015-2017年美国康奈尔大学食品科学系访问学者，江西省高层次引进人才，Frontiers in Nutrion首席客座编辑，《食品研究与开发》杂志青年编委，赣南医学院高层次引进人才，Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry、Food Research International、Journal of Food and Drug Analysis和LWT - Food Science and Technology等25个国际期刊审稿专家，2020年新加坡国际食品科学和营养大会组委会委员，中国营养学会会员，江西省营养学会会员。从事全谷物、浆果加工及其植物活性物质功能评价研究，先后主持赣南医学院高层次人才项目1项、校级博士科研启动基金1项、横向课题3项，参与国家自然科学基金项目3项、“十二五”国家支撑计划1项、食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目2项和赣鄱英才555工程项目1项。主持获得沈阳市自然科学学术成果三等奖。在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food Chemistry和《食品工业科技》等国内外期刊发表科研论文35篇，SCI收录28篇，H指数为14，申请国家发明专利3项，参加国际会议并作口头报告4次。