食品界

《食品科学》：浙江工商大学张巧智讲师等：厌氧处理对黄茶生物活性的影响及γ-氨基丁酸富集的代谢组学分析

黄茶是我国六大茶类之一，属于轻发酵茶，独特的“闷黄”工艺造就了黄茶“黄汤黄叶、味甘鲜爽”的品质特征。黄茶富含多种营养成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖和护肝等保健疗效。γ-氨基丁酸（GABA）是一种四碳非蛋白氨基酸，具有镇定安神、降血压、改善睡眠、抑制癌细胞转移等多种生理功能。研究发现，GABA属一类逆境响应产物，对维持植物中碳氮代谢的平衡有重要作用。当植物受到冷冻、盐胁迫、低氧、高温或机械损伤等逆境胁迫时，GABA含量会显著富集，可据此制备富含GABA的茶产品（即伽玛茶）。

浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江食品质量安全工程研究院的章垚琪、张巧智*等以黄茶为研究对象，经厌氧处理制得高GABA含量的黄茶，分析处理后黄茶中活性物质的含量变化，比较厌氧处理后黄茶的体外抗氧化活性、抗糖基化活性及降糖活性变化，进一步通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）联用技术通过类靶向代谢组学分析厌氧处理促进黄茶中GABA快速累积的机理，揭示厌氧过程中黄茶的关键代谢途径差异，阐明黄茶厌氧过程中主要品质成分的变化机制，以期为GABA保健茶的研究开发以及茶叶品质的提升提供参考依据。

1、靶向代谢组学定量分析GABA及其他游离氨基酸含量

如图1所示，未处理黄茶中GABA含量为153.2 μg/g，这与张金玉等测得的绿茶（0.03～0.05 mg/g）和红茶（0.07～0.11 mg/g）中GABA含量相近。经厌氧处理后，黄茶中GABA含量提升至3300.5 μg/g，提高了超20 倍，且已达到日本茶业届对伽玛茶中GABA含量的标准（1.5 mg/g以上）。植物中GABA的合成主要受谷氨酸脱羧和多胺降解反应的影响。据报道，低氧条件会导致细胞内pH值从正常生理值降低，从而激活植物中谷氨酸脱羧酶（GAD）的活性。因此对鲜茶进行厌氧胁迫处理，可激发酶促反应，促使L-谷氨酸经GAD催化、转化合成和多胺降解形成GABA。

2、厌氧处理后黄茶的总酚、总黄酮含量变化

如表1所示，未处理黄茶的总酚含量为181.2 mg/g，总黄酮含量为203.0 mg/g，而厌氧处理后黄茶的总酚和总黄酮含量分别为245.5 mg/g和333.2 mg/g。厌氧处理使黄茶的总酚含量极显著升高了35%（P＜0.01），总黄酮含量极显著升高了64%（P＜0.01）。Kim等采用连续厌氧工艺处理绿茶后发现，茶叶中主要茶多酚（如表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子酸儿茶素）含量显著上升；类似地，吴春兰等以真空交替透气处理毛叶茶，发现处理后的茶叶总黄酮含量显著提升，但个别茶多酚含量有所降低。黄茶中总酚含量增加可能与厌氧发酵过程中发生的氧化、水解等反应有关。

3、厌氧处理后黄茶的体外抗氧化活性变化

DPPH自由基清除能力

如图2A所示，黄茶提取物的DPPH自由基清除率与其质量浓度呈剂量相关。厌氧处理前后，黄茶提取物的DPPH自由基清除IC₅₀值分别为0.029 mg/mL和0.016 mg/mL，差异极显著（P＜0.01）（表1）；相比之下，抗坏血酸的DPPH自由基清除IC₅₀值为0.024 mg/mL。这说明黄茶提取物具有较好的DPPH自由基清除能力，且厌氧发酵增强了黄茶的抗氧化活性，这可能与处理过程中GABA、黄酮类物质和疏水性氨基酸等活性成分的富集有关。

ABTS阳离子自由基清除能力

如图2B所示，黄茶提取物的ABTS阳离子自由基清除率随其质量浓度的上升而增强。由表1可知，厌氧处理前后，黄茶提取物的ABTS阳离子自由基清除IC₅₀值分别为0.16 mg/mL和0.027 mg/mL，差异极显著（P＜0.01）。厌氧发酵后，黄茶提取物的ABTS阳离子自由基清除能力强于抗坏血酸（IC₅₀＝0.045 mg/mL），且强于杨高中等报道的绿茶（IC₅₀＝0.23 mg/mL）和乌龙茶提取物（IC₅₀＝0.38 mg/mL）。可见，黄茶对ABTS阳离子自由基有很强的清除能力，厌氧处理过程进一步提高了其抗氧化效用。

FRAP分析

由表1可知，未处理和厌氧发酵后黄茶的FRAP值为0.62 mmol/（L·g）和0.86 mmol/（L·g），差异极显著（P＜0.01）。数值高于马慧等测得的绿茶（0.044 mmol/（L·g））和茉莉花茶（0.041 mmol/（L·g）），但低于李晓飞测得的白茶（2.33 mmol/（L·g））。同样的，厌氧发酵处理提升了黄茶的总抗氧化能力。

4、厌氧处理后黄茶的体外抗糖基化活性分析

如图2C所示，在BSA-核糖反应模型中，黄茶的加入降低了体系中AGEs的生成水平，且这一抑制效果呈剂量-效应关系。由表1可知，未处理和厌氧发酵后黄茶提取物抑制AGEs形成的IC₅₀值分别为11.8 mg/mL和3.75 mg/mL，差异极显著（P＜0.01）。厌氧发酵处理大幅提升了黄茶的抗糖基化活性。茶叶的活性物质，如茶多酚和茶氨酸等，可能通过清除自由基、钝化过渡金属以及捕获活性反应中间体等多种途径阻断反应进程，达到抑制蛋白质糖基化损伤的效果。

5、厌氧处理后黄茶对淀粉消化酶的抑制活性变化

如表2所示，厌氧处理前后黄茶的α-淀粉酶抑制IC₅₀值分别为1.34 mg/mL和2.28 mg/mL，但低于阿拉伯糖的抑制活性（IC₅₀＝0.08 mg/mL）。郭爽爽等测得陈化1 h的茯砖茶的α-淀粉酶抑制IC₅₀值为5.7 mg/mL，Li Songjie等测得鹧鸪茶的α-淀粉酶抑制IC₅₀值为3.96 mg/mL，均低于本实验中黄茶的抑制活性。

6、代谢组学解析厌氧处理促进黄茶富集GABA的机理和代谢途径变化

PLS-DA与差异代谢物筛选

差异代谢物通路分析

如图4所示。厌氧处理过程中，氨基酸的生物合成和色氨酸代谢途径受调控的差异代谢物最多，分别为12 种和7 种；其次为磷酸戊糖途径、黄酮和黄酮醇生物代谢、丙烷、哌啶和吡啶类生物碱的生物合成等，这与厌氧处理后茶叶中的主要差异代谢物为氨基酸、有机酸、类黄酮和糖类等相符。此外，光合生物体中的碳固定作用、苯丙氨酸代谢、柠檬酸循环（三羧酸循环）和丁酸代谢等途径也受到影响。由此可见，厌氧处理导致黄茶中多种代谢途径受到干扰。

以图4中受到调控最为显著的丁酸代谢通路为例（P＝0.013），L-谷氨酸和琥珀酸半醛是黄茶代谢中GABA合成的上下游物质。其中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中，厌氧处理提高了1-吡咯啉-5-羧酸酯、L-谷氨酰胺和2-氧代戊二酸酯含量，在相关酶的作用下合成了L-谷氨酸，L-谷氨酸进一步在GAD作用下生成GABA；在三羧酸循环中，琥珀酸含量升高，在琥珀酰辅酶A催化作用下形成琥珀酸半醛，L-谷氨酸和琥珀酸半醛发生转氨反应，可逆生成GABA。此外，在精氨酸和脯氨酸代谢通路中，γ-谷氨酰-氨基丁酸经γ-谷氨酰-γ-氨基丁酸水解酶催化作用、4-乙酰氨基丁酸酯经精氨酸脱羧酶通路、4-氨基丁醛和4-胍基丁酸均可生成GABA，如图5所示。

结论

对厌氧处理后黄茶中GABA的富集以及其他活性成分的含量进行分析，系统比较了厌氧发酵对黄茶主要生理功能以及代谢组分的影响。结果表明，厌氧处理后黄茶中GABA含量大幅升高，导致其上下游氨基酸的含量发生了变化；同时，厌氧处理对黄茶中的多种酚类物质具有富集作用。黄茶本身具有较为理想的抗氧化、抗糖基化和降糖活性，厌氧处理后其活性没有丧失，且部分功能活性得到了显著增强，这可能与黄茶中GABA和类黄酮等物质的含量上升有关。通过代谢组学筛选出差异代谢物，主要包括氨基酸、有机酸、类黄酮、类核苷酸和糖类等。差异代谢物涉及的通路包括氨基酸的生物合成代谢、色氨酸代谢、类黄酮生物代谢和丁酸代谢等。以上研究结果揭示了黄茶厌氧过程中主要差异代谢物的变化规律。黄茶经厌氧处理后GABA和黄酮含量得到了同步提升，且具有理想的生理保健活性，可以作为高品质GABA茶的优异材料，本研究为进一步研究和开发GABA富集茶提供了理论依据。