食品界

FSHW | 青钱柳多糖及其磷酸化衍生物可以有效通过线粒体内在途径诱导结肠癌CT-26细胞的凋亡

Introduction

世界卫生组织报告，癌症是全球第二大死因，仅在2018年就有约960万人死亡。此外，据预测，2032年新的癌症患者人数可能增加到2400万人。目前，结直肠癌（CRC）每年导致100多万新病例，是癌症死亡的第二大原因，约占全球癌症负担的9%。目前传统的癌症治疗方法包括手术、化疗和放疗。然而，这些方法有严重的副作用，如对正常细胞的毒性和免疫损伤。因此，迫切需要找到一种低副作用或无副作用的新化合物。

植物多糖因其相对较低的毒性和各种生物活性，如抗氧化、保护肝脏、免疫调节活性，特别是抗肿瘤活性，正引起全世界的关注。最近，大量研究表明，从植物中提取的天然多糖，如Trametes orientalis、E. sipunculoide和绿茶，具有很强的抗肿瘤特性和低毒性。一些多糖已被开发为具有预防癌症特性的功能性食品，而其他多糖则被用作治疗癌症的前体或作用分子。

越来越多的研究发现，多糖的生物活性与其结构密切相关，如单糖组成、官能团、取代度、链构象等。最近，大量研究人员开始关注在多糖链中引入适当的离子基团（如磷酸基团和硫酸基团），因为它们不仅可以提高多糖的水溶性，而且可以改变多糖的结构，从而提高多糖的抗肿瘤性能。

青钱柳（Cyclocarya paliurus）别名：摇钱树、麻柳，青钱李、山麻柳、山化树。青钱柳多糖（CP）是青钱柳的主要功能物质之一，因其抗氧化、抗的生长有明显的抑制作用。然而，关于CP对结直肠癌细胞作用的研究较少，其可能的分子机制尚不明确。

南昌大学食品学院的谢留明博士，申明月副研究员，谢建华研究员等通过化学修饰成功获得了CP的磷酸化衍生物（P-CP），研究了CP和P-CP对结直肠癌CT-26细胞的抑制作用，并进一步研究了CP和P-CP对CT-26细胞的潜在机制。同时，选择正常小鼠肠道上皮细胞IEC-6来评估CP是否具有毒性。通过与CP的比较，可以清楚地发现磷酸盐基团对CP抗肿瘤性具有显著的影响，这为扩大青钱柳的应用提供了理论依据。

Results and Discussion

对CT-26细胞增殖的影响

为了判断CP和P-CP是否能抑制CT-26细胞的增殖，用CCK-8试剂盒评估了用CP或P-CP培养的CT-26细胞的活力。如图1A、1B和1E所示，CP和P-CP可以明显抑制CT-26细胞的增殖，且具有剂量和时间依赖性。用CP（800 μg/mL）处理48小时后，与未处理的细胞相比，细胞的活力急剧下降到68.28%。此外，在所有相同的浓度下，P-CP的生长抑制作用明显强于CP。值得注意的是，在800μg/mL时，P-CP的抑制作用与阳性的5-氟尿嘧啶（5-Fu）差不多，后者是一种高效的抗癌药物。此外，毒性评价是研究多糖生物活性的重要步骤。一些研究者发现，磷酸化的多糖衍生物对肿瘤细胞具有更多的细胞毒性和/或抑制活性，而对正常细胞的细胞毒性作用较小。CP和P-CP处理在所有浓度下对IEC-6细胞的生长都没有明显的抑制作用，而5-Fu可以明显杀死IEC-6细胞（图1C和1D），虽然在较低浓度下对CT-26细胞生长表现出较高的抑制率（图1A和1B），这些都说明CP或P-CP对IEC-6细胞没有明显的细胞毒性作用，对CT-26细胞表现出明显的抑制作用。

图1 CP和P-CP对CT-26细胞增殖有抑制作用

细胞形态

图2A显示了CP或P-CP处理后CT-26细胞的形态特征，表明与未处理组的正常CT-26细胞相比，CP和P-CP处理后的细胞有明显的形态变化（如细胞体积缩小，细胞膜脱落，细胞颗粒度增加）。更有趣的是，当施用高浓度的CP和P-CP时，可以观察到细胞上的玻璃状形态，表明CP和P-CP选择性地附着在癌细胞上被内化。用Hochest 33258进行核染色，研究CT-26细胞在CP和P-CP处理下的凋亡细胞核的情况。如图2B所示，可以看到处理后的细胞出现染色质凝结、核裂解和凋亡体，说明CP和P-CP可以诱导CT-26细胞凋亡，而且这些现象在P-CP组更为明显。

图2 CP和P-CP浓度对CT-26细胞形态的影响

ROS产生、细胞内[Ca²⁺]离子、细胞内pH和MMP

随着CP和P-CP浓度的增加，ROS荧光强度持续增加（图3A）。此外，磷酸盐基团的加入增加了ROS水平，特别是在高浓度下。[Ca²⁺]离子是一种常见的信号分子，在细胞凋亡的信号通路中起着重要作用。CP和P-CP的处理使[Ca²⁺]离子的水平急剧上升（图3B）。有趣的是，与CP处理的细胞相比，P-CP处理的细胞明显促进了[Ca²⁺]离子水平的增加。结合这些数据，可以说明细胞内[Ca²⁺]离子的降低可能是诱导肿瘤细胞在CP和P-CP处理下凋亡的一个重要原因。

细胞内pH值的降低可以直接改变MMP，使其产生负作用，造成其负面效应，导致线粒体功能紊乱。所有处理组的细胞pH值都有明显的下降，表明CP和P-CP都能导致细胞内酸化，而P-CP表现出比CP更强的降低作用（图3C）。

越来越多的研究表明，MMP的崩溃也可能导致线粒体功能紊乱，这在多糖诱导的细胞凋亡中起着双重作用。为了研究CP和P-CP诱导的细胞凋亡是否通过线粒体凋亡途径发生，用JC-1试剂盒检测CT-26细胞上MMP的变化，其荧光探针可有目的地进入线粒体，其荧光颜色由红变绿，作为流式细胞仪检测MMP变化的标志。随着CP和P-CP浓度的增加，低膜电位的细胞比例明显增加，这表明CP和P-CP可以破坏MMP，而且对P-CP处理的细胞表现出比CP处理的细胞更强的增加作用（图3D）。

图3 CP和P-CP处理增加了（A）ROS生成和（B）细胞内[Ca²⁺]离子;降低了（C）细胞内pH；（D）CT-26细胞MMP

Conclusion

总之，CP对CT-26细胞有较高的抑制率。CP处理可引起细胞内酸化，使细胞周期阻滞在S期，增加活性氧的生成。此外，CP处理引发线粒体膜电位去极化和Ca²⁺超载，打破了抗氧化系统、Na⁺/K⁺-atp酶和Ca²⁺-atp酶的平衡。另外，CP可以通过提高caspase-3和-9的活性以及提高细胞色素c的水平诱导细胞凋亡。有趣地是，磷酸化修饰增强了CP的抗肿瘤活性。提示CP是一种潜在的天然结肠癌治疗剂，磷酸化是提高CP抗肿瘤活性的有效方法。但多糖的构效关系与CP抗人结肠癌的临床应用仍需进一步研究。

第一作者

谢留明，南昌大学食品学院2020级博士研究生（硕博连读），中国生物工程学会会员，主要研究方向为多糖及生物活性研究。近3年，以第一作者或共一在Trends in Food Science & Technology, Carbohydrate Polymers, Food and Chemical Toxicology等国际高水平期刊上发表SCI论文8篇(7篇为中科院一区)，其中高被引论文1篇。文章总被引次数达100多次，累计IF近70，单篇最高影响因子＞12。参与国家级基金项目2项，主持省级研究生创新专项资金项目1项（YC2021-B022）。

通信作者

谢建华，南昌大学赣江特聘教授，研究员，博士生导师。现任南昌大学食品科学与技术国家重点实验室副主任、国际食品创新研究院副院长。入选国家高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才，科睿唯安2020、2021年度全球“高被引科学家”榜单，享受国务院政府特殊津贴专家、江西省百千万人才工程，江西省首批青年“井冈学者”，江西省杰出青年人才资助计划；美国普渡大学（Purdue University）博士后。兼任中国农学会农产品贮藏加工分会常务理事、中国青年科技工作者协会理事、生物医药专业委员会委员；Journal of Functional Foods、Food Science and Human Wellness、《未来食品科学》等国内外学术期刊副主编、编委，美国食品科学技术学会(IFT)会员, 多个国家重大人才工程、国家重点研发计划项目等评审专家，国家科技奖审评专家库成员，Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Food Chemistry、Food Hydrocolloids、Carbohydrate Polymers等30多个国际权威期刊审稿人。主要研究方向为食品化学与营养学、食品生物活性成分结构与功能。近年来主持国家自然科学基金及省部级项目20余项；在国内外重要期刊上发表论文180余篇，其中SCI论文150篇（75%为本领域一区刊物），迄今发表的SCI论文被引用5200余次，H指数44，多篇文章被评为ESI高被引论文和热点论文，申请或授权国家发明专利 20余件，参编著作5部（其中2部为国家级规划教材）、译著1部，英文专著1章，获江西省自然科学一等奖、二等奖等省部级以上奖励5项。

通信作者

申明月，副研究员，硕导，美国加州大学戴维斯分校博士后，南昌大学“赣江青年学者”，2021年入选科睿唯安年度全球“高被引科学家”榜单。主要研究方向为食品化学与营养、食品安全。近5 年，主持国家自然科学基金项目2 项，省部级以上项目5 项，参与国家“973”、国家重点研发计划、“十二五”科技支撑计划等国家级课题10 项。以第一或通信作者在LWT-Food Science and Technology、Food Chemistry、Food Hydrocolloids等SCI期刊发表论文56篇。申请国家发明专利19 件，其中授权国家发明专利12 件，获江西省自然科学二等奖、江西省优秀博士学位论文奖等省部级奖励，入选江西省首批培养类“双千计划”。