食品界

J. Future Foods | 基于液相色谱-串联质谱法测定食品中淫羊藿苷、金丝桃苷及补骨脂素

Introduction

功能（保健）食品通过调节人体机能，改善健康状态，人们对功能（保健）食品的需求也不断增加，因此，功能（保健）食品的发展也愈演愈烈。这类食物中负责其功能的成分通常被称为“生物活性化合物”。生物活性化合物来自植物、动物或微生物，通常被认为是天然安全的。植物通过一级和二级代谢产生的具有生物活性的化合物，常被称为天然植物功效成分。

淫羊藿苷是中药淫羊藿中的主要有效成分，属于黄酮类，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、心血管保护、神经保护、促进骨生长，还具有补肾壮阳、抗衰老等。目前，食品工业上将其作为功能因子，在软胶囊、胶囊、劲酒等产品中广泛应用。金丝桃苷是一种常见的黄酮醇苷类化合物，具有护肝、心脑血管保护、神经系统保护、抗炎等多种药理活性，除此之外，金丝桃苷也是补肾中药菟丝子的主要活性成分。补骨脂素是补骨脂中的呋喃香豆素类化合物，广泛存在于北沙参、防风和独活等中药中，具有补肾助阳、抗肿瘤、神经保护、抗炎、抗氧化等药理活性，还可用于治疗类风湿性关节炎、白血病、阿尔茨海默病等疾病。

根据《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》（卫法监发﹝2002﹞51号），淫羊藿、菟丝子、补骨脂均在可用于保健食品的物品名单中。作为可用于保健食品的中药，淫羊藿、菟丝子、补骨脂在增强免疫类保健食品中广泛存在，而淫羊藿苷、金丝桃苷、补骨脂素是温肾壮阳填精益髓的主要功能成分。由于这些化合物功效比较明确，因此不法商贩往往以“食疗”为噱头，向普通食品中添加这些中药材，或者在其生产的产品中宣称添加了该类植物而实际未添加。

保健食品中不添加或者普通食品中非法添加，不仅损害消费者的权利，还可能威胁食用者的身体健康。因此，亟需建立检测食品中淫羊藿苷、金丝桃苷、补骨脂素等多组分的检测方法，为监管部门提供高效灵敏的定性定量检测手段，为摸底监测和打击违法违规行为提供技术支撑。

Results and Discussion

固态、液态样品前处理条件的优化

利用13种不同提取溶剂对保健用胶囊和果味饮料中淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素进行提取。如图1，70%甲醇水溶液对保健用胶囊样品的提取效果最佳，且用70%甲醇水溶液对含目标物样品进行二次提取，二次提取溶液中未检出目标成分，说明70%甲醇水溶液能对目标物充分提取。此外，不同溶剂对于果味固态（液态）饮料中三种目标化合物的提取效率如图1B和1C所示，结果表明，综合实验考虑，选用70%甲醇溶液作为提取溶剂更适宜。

图1 不同溶剂对保健用胶囊(A)、固态试样(B)、液态试样(C)中目标化合物的提取效率

为选择合适的提取方式，对保健用胶囊和果味饮料的提取物分别进行加热回流20 min和超声20 min，结果如图2可知，超声提取方式的提取效果与加热回流提取效果相当，超声提取简单易行，故采用超声方式进行提取。

图2 不同提取方式对保健用胶囊(A)和果味饮料(B)中目标化合物的提取效率

利用超声的方式对保健用胶囊中的目标化合物进行辅助提取，明确了不同超声时间对试样中淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素的提取效率，结果如图3所示。保健用胶囊试样经过超声20 min后，淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素的响应值高于超声10 min的效果，超声20 min和30 min的提取效果没有明显差异。

图3 超声时间对含有淫羊藿苷、金丝桃苷、补骨脂素的保健用胶囊中三种目标化合物的提取效果

同时，也考察了超声时间对市售果味固体饮料中三种目标物的提取效率，如图4所示，试样经过超声20 min后，淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素的响应值高于超声10 min的效果，超声20 min和30 min的提取效果没有明显差异。

图4 不同超声时间对目标化合物的提取效率

半固态样品前处理条件的优化

本实验选取海底捞牛油火锅底料为研究对象，考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃取3种净化方式，并选择HLB和PRiME HLB等不同类型的固相萃取柱进行净化效果的比较。结果表明（图5），液液萃取法和分散固相萃取法虽然方法简单，但净化效果不理想，净化液较混浊，回收率偏低，使用HLB 及PRiME HLB固相萃取柱净化后，净化液澄清透明，且回收率均大于80%，但HLB 固相萃取柱需经活化、上样、淋洗和洗脱等多个步骤，操作繁琐，而PRiME HLB 固相萃取柱可以一步法净化，在保证净化效果的同时简化了前处理步骤，提高检测效率。因此，净化方法选择PRiME HLB固相萃取柱净化。

图5 不同净化方式对火锅中目标化合物的提取效率

仪器条件的优化

首先，比较了乙酸铵水溶液-乙腈流动相体系和甲酸水溶液-乙腈流动相体系的分离效果。在流动相中加酸可抑制电离、改善峰形，但酸浓度过高会抑制在负离子模式下的离子化效率。最终选择了0.1%的甲酸水溶液-乙腈作为流动相。采用梯度洗脱，具体见表1。

表1 梯度洗脱条件

此外，考察了3种化合物在Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱、Waters ACQUITY BEH C₁₈色谱柱、Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱和Phenomenex Kinetex F5柱上的分离效果。故选择Waters ACQUITY BEH C₁₈色谱柱（100 mm × 2.1 mm, 2.5 μm）柱作为本方法的色谱柱。图6为3种目标化合物的提取离子色谱图。

图6 淫羊藿苷、金丝桃苷、补骨脂素特征离子色谱图

对离子源参数、质谱参数进行了优化。优化后的质谱参数见表2。

表2 优化好的质谱条件

方法考察

采用70%甲醇溶液和固体饮料、液体饮料、配制酒、液态剂、片剂、胶囊剂型保健食品、固体火锅底料、半固体火锅底料基质进行实验。结果表明（表3），在不同基质中3种化合物的 |ME| 均小于20％，说明3种化合物存在弱基质效应，且检测实际样品时，通常需进行多倍稀释，故本研究采用70%甲醇溶液配置溶剂标准曲线。

表3 淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素的基质效应

表4 淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素标准曲线的回归方程和线性关系

本方法中液态试样中补骨脂素的检出限为0.500 μg/L、淫羊藿苷的检出限为12.5 μg/L、金丝桃苷的检出限为5.00 μg/L；固态试样和火锅底料试样中补骨脂素的检出限为0.500 μg/kg、淫羊藿苷的检出限为12.5 μg/kg、金丝桃苷的检出限为5.00 μg/kg。
表5 方法的准确度和精密度

Conclusion

本研究对不同食品中淫羊藿苷、金丝桃苷和补骨脂素的前处理过程进行了优化，确定了较好的提取条件，采用液相色谱-质谱联用技术对3种目标化合物进行测定。固体饮料、保健食品（胶囊和片剂）样品采用超声辅助提取70%甲醇溶液提取，旋涡离心，高效液相色谱-质谱联用法测定。液体饮料、保健食品（口服液形式）和配制酒类样品用70%甲醇溶液稀释，旋流后采用HPLC-MS/MS测定。对固体和半固体火锅调味料样品先用正己烷脱脂处理，70%甲醇溶液超声辅助提取，旋涡离心，PRiME HLB净化化，HPLC-MS/MS测定。与现有方法相比，该方法具有适用性广、分析时间短的优点。该方法为监管部门提供了一种高效、灵敏的定性、定量判定方法，为下属监管部门打击违法行为提供技术支持。

第一作者

范素芳，女，理学博士，高级工程师，河北省青年拔尖人才，河北省“三三三人才工程”二层次人才，主要从事食品中风险物质检测技术开发，食品安全与质量分析等方面的研究。主持、参与省部级以上科研项目10余项，科研成果获省部级科研奖励11项，在国内外期刊公开发表学术论文40余篇。

通信作者

张岩，男，研究员，医学博士后，河北省食品检验研究院副院长，享受国务院特殊津贴专家，河北省“三三三”人才工程第一层次人选，河北省青年拔尖人才，国际标准化组织生物技术委员会生物分析方法工作组专家，第二届食品安全国家标准审评委员会委员，国家市场监管总局北京冬奥会食品供应安全工作协调小组专家组成员，北京市2022年冬奥食品安全保障专家委员会委员。承担国家级科研项目和省部级科研项目30余项，发表高水平学术论文200余篇，参编出版专著24部，授权国家发明专利9项，登记计算机软件著作权8项；制修订国家标准54项、行业标准11项、地方标准65项，科研成果获得省部级科技进步奖25项。