食品界

浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心余方苗等：东海乌参肽对小鼠酒精性肝损伤及肠道菌群的调节作用

东海乌参（Acaudina leucoprocta）是重要的药食两用资源，具有蛋白质含量高、脂肪含量低的特点，海参多肽的制备及其生物活性分析是国内外功能活性成分研究的热点。前期关于东海乌参的研究主要集中在其非蛋白质化合物的抗炎、免疫调节和抗氧化作用，关于其蛋白质类活性成分对酒精性肝损伤的保护作用少有研究，

浙江海洋大学食品与药学学院的阙凡迪、余方苗*和舟山常青海洋食品有限公司的王娇燕等人建立研究小鼠酒精性肝损伤模型，分析东海乌参肽（ALPs）对小鼠氧化应激和炎症指标的影响，探讨ALPs对小鼠酒精性肝损伤、小鼠肠道菌群的影响以及肠道菌群紊乱的改善作用，为东海乌参资源的开发和利用提供参考。

1、ALPs分子质量分布

根据图1A中不同标准品的保留时间t与分子质量的对数lg m_w拟合得到线性回归方程lg m_w＝－0.268 2t＋7.237（R² ＝0.992 8）。根据ALPs不同色谱峰的保留时间分析ALPs分子质量分布情况，由图1B可知，ALPs中分子质量在1～3 kDa的活性肽占63.5%，分子质量小于1 kDa的活性肽占36.5%，没有分子质量大于3 kDa的组分。

2、ALPs对乙醇诱导小鼠体质量和肝脏指数的影响

如图2A所示，实验结束时，与其他组相比，正常组体质量极显著增加（P＜0.01）；实验结束时随ALPs剂量增加，ALPs干预组与正常组体质量的差异缩小；与模型组相比，阳性药物组和ALPs干预组小鼠体质量上升相对较快。由此可知，ALPs干预可以在一定程度上预防乙醇诱导的小鼠体质量下降。

如图2B所示，模型组小鼠肝脏指数极显著高于正常组（P＜0.01）。与模型组相比，阳性药物组和ALPs干预组的肝脏指数显著或极显著降低（P＜0.05、P＜0.01）。ALPs-H组肝脏指数与阳性药物组相近，推测其对肝脏的保护效果与阳性药物相近。

3、ALPs对乙醇诱导小鼠血清AST、ALT活力的影响

如图3所示，模型组AST和ALT活力较正常组极显著升高（P＜0.01），表明模型组肝脏功能减弱。与模型组相比，不同剂量的ALPs干预均能极显著降低小鼠血清AST和ALT活力（P＜0.01）。由此可知，ALPs可使乙醇诱导小鼠血清AST、ALT活力恢复正常，ALPs对酒精性肝损伤具有潜在的保护和修复作用。

4、ALPs对乙醇诱导小鼠肝损伤的影响

由图4A可知，与正常组相比，模型组肝小叶结构不完整，肝索排列紊乱，肝细胞中出现大量空泡状损伤。与模型组相比，低剂量ALPs处理显著改善了肝组织的形态，高剂量ALPs中的肝组织形态与阳性药物组相似。HE染色结果表明ALPs能有效缓解乙醇诱导的小鼠肝损伤。

油红O染色显示（图4B），与正常组相比，模型组的脂滴明显增多，表明乙醇暴露后肝脂肪变性。与模型组相比，阳性药物组和ALPs干预组小鼠肝脏中脂质积累明显减轻，且阳性药物组和ALPs-H组的效果相当，表明ALPs可以通过抑制小鼠的肝脏脂肪变性来减轻乙醇引起的肝损伤。小鼠肝脏TG含量（图4C）也印证了油红O染色结果。

5、ALPs对乙醇诱导小鼠肝组织中ADH和ALDH活力的影响

如图5所示，模型组大鼠肝组织匀浆中ADH和ALDH活力较正常组升高，说明饮酒后ADH和ALDH水平升高，以加速乙醇的代谢。与模型组比较，ALPs-H组和阳性药组肝组织ADH和ALDH活力均显著升高（P＜0.05）。

6、ALPs对乙醇诱导小鼠肝脏MDA、GSH含量和抗氧化酶活力的影响

如表1所示，与正常组相比，模型组小鼠肝MDA含量极显著升高（P＜0.01），而GSH、GSH-Px、CAT水平显著降低（P＜0.05），表现出明显的氧化应激；SOD活力虽然有一定程度的降低，但是并无显著性变化（P＞0.05）。与模型组比较，阳性药物组和ALPs-H组小鼠肝组织中MDA含量显著或极显著降低（P＜0.05、P＜0.01），GSH含量和抗氧化酶CAT、GSH-Px活力极显著升高（P＜0.01）。与正常组相比，ALPs-L组小鼠肝组织中CAT和SOD活力无显著性差异（P＞0.05）。结果表明，ALPs可以通过减少MDA的产生和提高抗氧化能力来减轻乙醇诱导的氧化应激。

7、ALPs对乙醇诱导小鼠肝组织中炎症细胞因子含量的影响

如图6所示，与正常组相比，模型组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6含量极显著升高（P＜0.01），表明肝脏有明显的炎症反应；而阳性药物组和ALPs组的TNF-α等炎症细胞因子含量较模型组极显著降低（P＜0.01）。结果表明ALPs可通过降低肝组织中炎症细胞因子含量，减轻炎症反应和肝细胞损伤，来达到改善肝功能的目的。

8、ALPs对乙醇诱导小鼠结肠损伤的影响

如图7所示，HE染色显示正常组结肠结构基本正常，黏膜完整，腺细胞在隐窝内有序排列。模型组上皮表面的细胞脱落并坏死，隐窝破坏，黏膜肌层破坏，炎症细胞浸润。相反，经ALPs处理的小鼠这些症状显著减轻。结肠AB-PAS染色结果显示模型组的小鼠结肠损伤后伴有杯状细胞数量减少和黏液层变性。给予ALPs干预后杯状细胞数量有所恢复，因杯状细胞可促进分泌黏蛋白，形成黏膜屏障。模型组小鼠结肠内蓝色区域较正常组较少，表明经过乙醇诱导后，结肠中酸性黏液物质或中性酸性混合黏液物质减少，而ALPs干预可促进结肠中黏液物质的分泌。

9、ALPs对乙醇诱导小鼠肠道菌群多样性的影响

Venn图可以直观展示几组样本中物种的相似性及重叠情况。如图8A所示，5 组样本中共检测出696 个OTU，模型组OTU最多，达到565 个；正常组OTU最少，达到497 个；阳性组、ALPs-L和ALPs-H的OTU数分别为533、536、531 个。其中5 组共有的OTU数为344 个，除此之外，正常组、模型组、阳性组、ALPs-L和ALPs-H拥有的OTU数分别为153、221、189、192、187 个，分别占各组总OTU数量的30.78%、39.12%、35.50%、35.82%和35.21%。

α-多样性指数是评估肠道菌群的丰富性和多样性的重要指标。如图8B～D所示，与正常组相比，模型组中ACE指数、Chao1指数和Shannon指数显著或极显著升高（P＜0.05、P＜0.01）；而与模型组相比，ALPs-L的ACE指数、Shannon指数和Chao1指数无显著差异（P＞0.05），ALPs-H组的ACE指数、Chao1指数和Shannon指数均显著或极显著降低（P＜0.05、P＜0.01），这也印证了Venn图的分析结果。

β-多样性分析可度量不同样本间菌群组成的相似度。PCA（图8E）和NMDS（图8F）的结果显示了正常组和模型组之间的微生物群离散分布，表明两组具有显著隔离的群集。同时，ALPs干预后小鼠的菌群组成与正常组更相似。

10、ALPs对酒精性肝损伤小鼠肠道菌群群落组成的影响

16S rRNA高通量测序结果显示酒精性肝损伤小鼠会出现肠道菌群紊乱。如图9A所示，小鼠肠道菌群在门水平主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroides）、放线菌门（Actinobacteria）和脱硫菌门（Desulfobacterota）等组成。模型组较正常组相比 Firmicutes相对丰度无明显性变化，但是Bacteroides、Desulfobacterota的相对丰度明显增加，Actinobacteria的相对丰度明显降低。给予ALPs可以逆转Bacteroides、Desulfobacterot和Actinobacteria相对丰度的变化。基于bray-curtis算法的层次聚类分析可知在门水平上5 组被分为2 类，I类包含正常组，II类包括其余4 组。其中ALPs-H组最接近正常组，其次是ALPs-L组。

如图9B所示，在纲水平上各组小鼠主要组成有梭菌纲（Clostridia）、杆菌纲（Bacilli）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）等。与正常组相比，模型组Clostridia和Bacteroidia相对丰度明显增加，Bacilli和Coriobacteriia的相对丰度明显降低。ALPs干预增加了Bacilli和Coriobacteriia的相对丰度，减少了Clostridia和Bacteroidia的相对丰度。ALPs干预有效逆转了由乙醇诱导的Clostridia和Bacteroidia相对丰度的增加以及Bacilli和Coriobacteriia相对丰度的降低。基于bray-curtis算法的层次聚类分析可知在纲水平上5 组被分为2 类，I类包括正常组与ALPs-H，与II类的3 组区分开来，说明ALPs干预后能在纲水平上改善小鼠肠道菌群组成，使菌群组成与正常组接近，说明ALPs有恢复菌群组成的作用。

在科水平上（图9C）各组小鼠主要组成有单球菌科（Monoglobaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、鼠尾草科（Muribaculaceae）和阿托波菌科（Atopobiaceae）等。与正常组相比，乙醇诱导增加了Monoglobaceae和Lachnospiraceae的相对丰度，降低了Erysipelotrichaceae和Atopobiaceae的相对丰度。ALPs干预后，这些菌群的相对丰度得到改善。基于bray-curtis算法的层次聚类分析可知，ALPs-L和ALPs-H科水平肠道菌群组成较为相似。

讨论

ALPs能够通过增强机体乙醇代谢能力，减轻乙醇引起的氧化应激和炎症反应，调节肠道微生物组成减轻乙醇诱导的肝损伤。因此，ALPs在开发预防酒精性肝损伤的保健食品方面具有广阔的前景。

作者简介

通信作者

余方苗，副研究员，硕士生导师，浙江海洋大学食品与药学学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心。主持国家自然科学基金青年科学基金、浙江省自然科学基金、浙江省博士后择优项目和企业横向项目等10 项。发表SCI和EI收录论文20余篇，授权发明专利8 件。主要从事海洋源蛋白肽的酶法制备、分离纯化及结构鉴定，海洋活性环肽的化学合成以及免疫调节功能活性化合物筛选等方面的科研工作。