氧化应激是自由基生成速率大于清除速率的一种状态。通常情况下，机体通过抗氧化防御系统维持着氧化还原平衡状态，但当发生氧化应激时，就会对机体的蛋白质、脂质、DNA等生物大分子造成损伤，进而引发衰老、炎症性肠病和其他慢性疾病。有效地控制机体的氧化应激反应是预防疾病发生的关键。摄入天然高效的抗氧化成分可以保护机体免受自由基侵害，以此调节氧化还原平衡，对预防人类疾病和提高健康水平有重要作用。食源性蛋白肽由于其营养价值高、吸收效率快以及具有多种生物活性备受研究者的青睐。鱼鳞中富含胶原蛋白和角蛋白，是食源性蛋白肽的优质原料。

福州大学生物科学与工程学院蔡茜茜、汪少芸*等前期研究制备了笛鲷鱼鳞多肽(CSSPs)，并通过体外化学指标的测定，证实了CSSPs具有较强的抗氧化活性。在此基础上，可推测CSSPs对氧化损伤的肠道细胞可能也具有保护作用，进一步缓解氧化应激所致的肠道疾病。因此，本次研究以H₂O₂诱导Caco-2细胞氧化应激损伤为模型，系统地评价CSSPs对氧化应激状态下Caco-2细胞的保护作用及其作用机制，为其应用于功能食品提供理论依据。

1、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞活力的影响

如图1A所示，CSSPs质量浓度为25～1 600 μg/mL时，细胞活力都大于95%，表明在此质量浓度范围内CSSPs不会影响Caco-2细胞活力。如图1B所示，添加不同浓度的H₂O₂处理Caco-2细胞4 h，H₂O₂作用浓度高于350 μmol/L处理组的细胞活力相比空白组均显著下降（P＜0.05），并且表现出浓度依赖性，说明提高H₂O₂的浓度会提高对Caco-2细胞的损伤。当H₂O₂浓度为650 μmol/L时，细胞活力急剧下降至52.4%，最接近半抑制浓度。因此在接下来的实验中，采用650 μmol/L H₂O₂作为诱导浓度。从图1C得知，CSSPs作用后，细胞活力比模型组显著上升（P＜0.05），此外，质量浓度800 μg/mL CSSPs的保护效果最强，细胞活力达到84.0%。以上结果证实了CSSPs能够降低H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化损伤程度，之后选取质量浓度50、200、800 μg/mL的CSSPs进行后续实验。

2、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞LDH活力和IL-8质量浓度的影响

由图2A可知，H₂O₂使Caco-2细胞的LDH释放量显著上升，是空白组的2.13倍。但经过CSSPs作用后，各组LDH活力相比于模型组均有明显下降，质量浓度200、800 μg/mL CSSPs处理效果显著（P＜0.05），表明CSSPs可有效地保护细胞的完整性，减轻H₂O₂的破坏作用。如图2B所示，细胞受到H₂O₂刺激时，与空白组相比IL-8的释放量显著增加（P＜0.05）。但是在CSSPs的作用下，与模型组相比细胞IL-8的分泌量呈浓度依赖性显著下降（P＜0.05）。此外，当CSSPs作用质量浓度为800 μg/mL时，IL-8质量浓度与空白组相比无显著性差异（P＜0.05）。结果表明，CSSPs可抑制细胞的氧化应激损伤，抑制炎症因子IL-8的分泌，具有调控炎症的潜力。

3、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化还原状态的影响

4、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞ROS相对含量的影响

如图4所示，以空白组细胞荧光强度为100%，模型组的ROS分泌量显著上升（P＜0.05），相比空白组增加了104%，表明H₂O₂会造成Caco-2细胞内ROS相对含量增加。模型组的Caco-2细胞经不同质量浓度的CSSPs作用后，ROS相对含量均显著下降（P＜0.05），说明CSSPs除了通过调节抗氧化酶的活性来维持细胞的平衡状态，也可直接清除胞内ROS来减轻细胞氧化损伤程度。

5、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞线粒体膜电位的影响

如图5所示，相比空白组，H₂O₂使线粒体膜电位降低，绿色荧光居多。CSSPs处理后，红色荧光呈浓度依赖性增强，绿色荧光减弱，有效抑制了H₂O₂引起的线粒体膜电位下降，避免了细胞的早期凋亡。这表明CSSPs在Caco-2细胞凋亡的过程中通过维持细胞线粒体膜电位的平衡，来抑制线粒体功能受损。

6、CSSPs对H₂O₂诱导的Caco-2细胞凋亡基因的影响

如图6所示，与空白组相比，H₂O₂的处理使促进凋亡的基因Caspase-3、Caspase-9和Bax相对表达量显著上升（P＜0.05），分别是空白组的2.17、1.97、2.20倍，而抑制凋亡的基因Bcl-2相对表达量相比空白组下降47.5%。因此可以得知，H₂O₂导致细胞凋亡基因Bax/Bcl-2的比值上升。但是在CSSPs的作用下，Caspase-3、Caspase-9和Bax mRNA相对表达量下降，Bcl-2 mRNA相对表达量上升。结果表明，CSSPs通过下调Caspase-3、Caspase-9和Bax mRNA表达，上调Bcl-2 mRNA表达，显著抑制细胞的凋亡，进一步说明CSSPs的保护作用与线粒体介导的凋亡途径有关。

结 论

本研究采用650 μmol/L H₂O₂构建Caco-2细胞氧化应激模型，研究CSSPs在细胞水平上抵御氧化应激的能力。结果表明，CSSPs通过降低上清液LDH活力、IL-8质量浓度以及胞内ROS相对含量，从而启动了细胞抗氧化防御系统，主要包括提高胞内SOD、CAT活力和GSH-Px活力，并且降低MDA含量。此外，进一步研究表明，CSSPs对H₂O₂造成的细胞凋亡具有一定的调节作用，其作用方式是通过提高细胞内线粒体膜电位，抑制促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA的表达，促进抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达，缓解H₂O₂引起的细胞凋亡。因此，CSSPs可有效缓解H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化应激损伤和凋亡，这为CSSPs进一步应用于功能性产品提供技术和理论指导。

作者简介

通信作者：

汪少芸，女，博士研究生，二级教授，博士生导师（福州大学生物科学与工程学院）美国威斯康星大学（UW-Madison）和美国加州大学戴维斯分校（UC-Davis）博士后，入选国家“万人计划”科技创新领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、省A类高层次人才、省高层次创新人才、省科技创新领军人才。担任国家食品科学与工程“一流专业”建设点负责人、省食品与生物工程“一流学科”负责人、省海洋生物制品与功能食品“2011协同创新中心”主任、省海洋生物制品绿色制造工程研究中心主任。兼任福建省健康工程学会副理事长、福建省食品科技学会副理事长，Food Science of Animal Products科学主编，Food Science and Human Wellness、Hans J Food and Nutrition Sci、《食品科学》、《食品工业科技》等期刊编委，《中外食品技术》首批翻译专家。长期从事食品功能蛋白质/多肽、功能因子稳态化和靶向递送的基础研究和应用开发工作，主持国家自然科学基金海峡重点基金、科技部重点研发专项课题等省部级以上和企业研发项目30余项，编写著作8部，获授权发明专利59件，发表论文300篇，其中被SCI/EI收录230余篇。获国际食品功能因子（ICOFF）学术大会奖、中国产学研合作创新成果一等奖、全国食品产学研优秀科研成果一等奖、中国化工联合会科技进步一等奖、省科技进步一等奖、省科技进步二等奖、省自然科学二等奖。获宝钢优秀教师奖、省优秀教师奖、省优秀科技工作者奖、卢嘉锡优秀导师奖、中国食品科技学会科技创新-杰出青年奖、厦航奖教金奖。担任教育部“长江学者”特聘教授和国家自然科学基金杰青/优青等人才项目的评审专家，担任科技部、国家留学基金委和省部级重大专项等科研项目的评审专家和国家海洋公益重大项目独立监审专家。

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