食品界

FSHW | 小麦球蛋白-1 S等位基因N-糖基化位点特异性鉴定及致敏性分析

Introduction

小麦是一种主要的粮食作物，因其较高的营养价值被广泛应用于面条、饼干、面包等加工食品中。然而，小麦可引发免疫球蛋白E（IgE）和非IgE介导的食物过敏反应，较为典型的症状有乳糜泻、面包师哮喘症、特异性皮炎和小麦依赖运动激发过敏症。据流行病学统计，世界上约有4000万人受到小麦过敏的困扰，由此引发的疾病甚至影响了亚太地区10%的儿童和中国北方地区3.6%的儿童。

糖基化修饰是一种蛋白质翻译后修饰的主要类型，对蛋白质的理化性质和生物活性有着重要影响。根据糖基化位点的不同可以分为N-糖基化和O-糖基化。前者主要发生在天冬酰胺残基的酰胺氮上，后者则多发生在羟脯氨酸的羟基上。多项研究表明，致敏原蛋白的N-糖基化可能影响其致敏性，进而影响IgE介导的超敏反应。

迄今为止，在小麦中已有28种蛋白质被世界卫生组织和国际免疫委员会登记为小麦致敏原。通常可以将这些小麦致敏蛋白分成三类：可溶性蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白。目前，已经发现在高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白和醇溶蛋白中均有N-糖基化的存在。同时，醇溶蛋白的N-糖基化也被进一步证明了与其致敏性之间存在相关性。然而，可溶性蛋白的N-糖基化与致敏性关系尚未阐明，亟需进一步系统性研究。

浙江工商大学王彦波教授、傅玲琳教授等从小麦中分离纯化出可溶性糖蛋白，并使用小麦过敏患者的血清进一步分析其致敏性；经质谱鉴定该可溶性糖蛋白为球蛋白-1 S等位基因（GSA），同时研究了其热稳定性、pH稳定性、IgE结合活性和蛋白质结构等理化性质；解析GSA的N-糖基化修饰，并揭示小麦N-糖链结构对其过敏性的影响。

Results

小麦糖蛋白的纯化和鉴定

采用HiTrap ConA 4B亲和层析柱和Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶层析柱对小麦中提取得到的可溶性蛋白进行富集纯化。如图1所示，亲和层析色谱图中可以观察到一个峰，其馏分包含多个分子量在40 kDa左右的条带。进一步纯化收集洗脱峰，通过SDS-PAGE分析第二个最高峰，观察到分子量约为56 kDa的细条带和分子量约为36 kDa的宽条带。比对鉴定纯化后的糖蛋白即为含有多个亚基的GSA，其分子量为56 kDa。

（A）AKTA蛋白纯化系统亲和层析色谱图及SDS-PAGE图。M：Marker；1：亲和层析纯化GSA；2：粗蛋白。（B）AKTA蛋白纯化系统凝胶过滤层析色谱图及SDS-PAGE图。M：Marker；1：亲和层析纯化GSA；2：分子筛纯化蛋白。

图1 GSA的纯化

GSA的表征

采用苯酚-硫酸法测定纯化后的GSA总糖含量为（3.826±0.275）%。使用肽-N-糖酰胺酶去除纯化后GSA中的N-糖链以制备去-N-糖基化GSA。如图2A所示，去-N-糖基化后，44.3～66.4 kDa区域内的电泳条带颜色变浅，而29.0～44.3 kDa区域内的条带颜色加深并向下移。这表明，去-N-糖基化GSA比原蛋白质的分子量更低，证明小麦GSA中存在N-糖链。

A）SDS-PAGE图。M：Marker；1：GSA；2：去-N-糖基化GSA。（B）Western Blot图。M：Marker；1：GSA；2：去-N-糖基化GSA。（C）ELISA图。

图2 GSA和去-N-糖基化GSA的IgE结合能力分析

GSA的IgE结合活性

采用酶联免疫吸附法（ELISA）和蛋白质印记法（Western blot）两种方法来检测GSA的IgE结合活性。如图2所示，与空白对照和阴性对照相比，GSA表现出显著的IgE结合活性。结果表明GSA是小麦中的致敏原。

通过比较去-N-糖基化GSA和GSA与IgE结合活性进一步分析N-糖基化对小麦GSA致敏性的影响。Western blot结果表明（图2B），GSA 44.3～66.4 kDa的蛋白亚基与IgE结合能力较弱，而在29.0～44.3 kDa区域有明显的条带。同时，并未观察到明显的去-N-糖基化GSA条带。ELISA结果证实（图2C），去-N-糖基化GSA的IgE结合能力显著降低。以上结果表明，N-糖链在小麦GSA的致敏性中起着至关重要的作用。

GSA的二级结构

采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了GSA的二级结构。红外光谱中酰胺I带（1600～1700 cm^-1）包含可能反映蛋白质二级结构的全局信息。通过OMNIC和Peakfit软件进行去卷积和二阶导数分析，计算得GSA二级结构包含51.8 % α-螺旋、8.8% β-折叠、32.6% β-转角和41.8%无规则卷曲。

GSA的热稳定性和pH稳定性

通过SDS-PAGE和ELISA分析研究GSA的热稳定性和pH稳定性。如图3A所示，随着温度从80 °C升高至100 °C，GSA的所有条带分散。同时，ELISA结果表明（图3B），在80～100 °C温度范围内，GSA与IgE的结合能力逐渐降低。在弱酸性和碱性条件下（pH 6.0～11.0），GSA与IgE的结合能力以及SDS-PAGE电泳条带均相对稳定。然而，在酸性条件下（pH 3.0），GSA的IgE结合活性降低，SDS-PAGE条带严重变形。此外，在强酸性条件下（pH 1.0），小麦GSA的IgE结合活性略有增加（图3C和D）。

（A）和ELISA分析（B），GSA pH稳定性的SDS-PAGE电泳分析（C）和ELISA分析（D）。

图3 GSA热稳定性的SDS-PAGE电泳分析

GSA的N-糖基化位点特异性分析

为确定位点特异性的糖基化位点以及每个糖基化位点的寡糖异质性，将纯化后的GSA消解为肽段，其酶解多肽和糖肽类的混合物经C₁₈-RPLC-MS/MS（HCD）检测分析。结果证实，N-糖肽中含有N-聚糖。同时，在N-糖肽中只检测到一个N-糖基化位点N₃₀₀（图4）。如表1所示，GSA蛋白中鉴定出6条与糖肽连接的N-糖链。其中3条为高甘露糖型（Hex₆HexNAc₂，Hex₇HexNAc₂，Hex₃HexNAc₂），另外3条为复杂型（Hex₃HexNAc₂Galactose，Hex₄HexNAc₂Galactose，Hex₄HexNAc₃Fucose₂）。

蓝色方块代表GlcNAc，绿色圆圈代表Man，黄色圆圈代表Galactose。

图4 N-糖肽的C₁₈-RPLC-MS/MS二级质谱图

表1 GSA蛋白的N-糖链结构及组成

如图5所示，所有的N-糖链都具有五糖核心结构（GlyNAc-GlyNAc-Man(Man)-Man）。与4号N-糖链相比，1号N-糖链多了一个Galactose结构，6号N-糖链各多了一个Galactose结构和一个Man结构。2、3号都是典型的高甘露糖型，与4号的区别在于连接的Man结构数量不同。5号是六条糖链中结构最为复杂的一条N-糖链。其N-糖链的非还原性末端连接了一个Fucose（岩藻糖）和一个GlyNAc，还原性末端也连接了一个岩藻糖结构。

图5 GSA N-糖链的C₁₈-RPLC-MS/MS二级质谱图

Discussion

研究表明，小麦致敏蛋白的N-糖基化与其致敏性密切相关，进一步影响IgE介导的超敏反应。本研究中分离纯化了一种小麦可溶性蛋白GSA，并证实了其具有较高的致敏性。重点分析了GSA的N-糖链结构，同时发现去-N-糖基化后的GSA致敏性显著降低。由此可以推测N-聚糖可以通过掩蔽内部表位或参与暴露的外部表位的形成来影响致敏蛋白的致敏性。此外，N-糖链的部分结构可能具有免疫原性，从而直接增强致敏蛋白的致敏性。
大多数食物致敏原可以在热处理和酸处理条件下仍保持免疫反应。然而，本研究发现小麦GSA在强酸性条件下（pH 3.0）不稳定，IgE结合活性降低。其原因可能是强酸性处理导致蛋白质变性，从而使得表位被破坏。而在pH=1.0条件下略有增加，可能是因为酸性处理使得蛋白质构象变化，导致内部表位暴露。此外，小麦GSA在高温条件下不稳定会降解，导致其IgE结合活性降低。这可能是由于热处理后GSA发生变性和聚集，表位被掩蔽。也有可能是因为致敏蛋白在不同条件下暴露不同表位，从而导致其IgE结合活性发生变化。

Conclusion
本文从小麦中分离纯化了一个分子量为56 kDa的可溶性糖蛋白，并鉴定其为小麦致敏原。该糖蛋白具有显著的小麦特异性IgE结合活性。同时研究了该糖蛋白的理化特性，如N-糖基化位点、N-糖链结构、二级结构以及热稳定性和pH稳定性。结果表明，小麦糖蛋白主要为GSA，其糖含量为（3.826±0.275）%；通过质谱鉴定其具有一个糖基化位点N₃₀₀，连接着6条不同的N-糖链，其中3条为高甘露糖型，3条为复杂型；通过去除N-糖基结构、热处理和强酸性处理可以降低GSA的免疫原性，为低致敏性小麦产品的开发提供了理论支撑。