食品界

《食品科学》浙江工商大学张晓頔等：鱼糜副产物蛋白水解物的抗冻活性及对嗜热链球菌的抗冻效果及机制

低温冷冻是保存食品和菌种常用的方法，冷冻时需要添加抗冻剂以抑制冰晶的生成，防止机体受到机械损伤。嗜热链球菌是食品工业中被广泛应用的乳酸链球菌发酵剂。真空冷冻干燥和低温保存是浓缩和保存菌种最有效的方法，在干燥和随后长期的低温保存过程中，可通过添加抗冻剂来减少低温对细胞的损伤，最大限度保持其具稳定性和活性，降低食品工业中嗜热链球菌使用的经济成本。研究表明，具有抗冻活性的蛋白质水解物即抗冻多肽，对生物体有直接的保护作用，抗冻多肽作为一类新型的食品添加剂，具有抑制冰晶生成和重结晶的作用，可减少对细胞的损伤，进而提高冷链食品的品质。

浙江工商大学海洋食品研究院、浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室张晓頔、董烨、戴志远*等人评价了鱼糜加工副产物蛋白水解物（SBPH）的抗冻活性及氨基酸组成和序列，并探究SBPH对嗜热链球菌的冷冻保护作用机制，为其在食品中的应用提供理论参考。

1、SPBH分子质量分析

图1为SBPH的高效液相色谱图。由图1和表1可见，与未水解的鱼糜副产物相比，SBPH中分子质量为1000~2000Da的组分占11.6%，分子质量小于1000Da的组分占87.16%。分子质量为600~2700Da的多肽可抑制冰的重结晶，具有一定的抗冻活性。本实验制得的SBPH分子质量范围260Da~2550Da，小于2000Da的SBPH占98.8%，推测其具有抗冻活性。

2、SBPH氨基酸组成及多肽序列的鉴定分析

蛋白水解物的抗冻活性不仅与分子质量相关，还与其氨基酸的组成和排列有关。表2为SBPH的氨基酸组成，在SBPH中共鉴定出78个长度为8~ 18个氨基酸(分子质量为761.37 ~ 1 652.81 Da)的多肽，根据综合得分选出32个活性肽段，活性肽段序列结果见表3。

氨基酸组成、分子质量和多肽序列是影响多肽生物活性的关键结构特征此外，氨基酸的排列对其抗冻活性也有很大影响。多肽的氨基酸组成与抗冻活性密切相关，氨基酸组成结果显示，SBPH富含甘氨酸（8.70%）、脯氨酸（8.32%）、谷氨酸（11.54%）和丙氨酸（6.84%），这与蛋白水解物的抗冻活性有关。脯氨酸和丙氨酸残基提供的非极性环境，可维持多肽与水分子间的氢键，从而抑制冰晶的生成，发挥其抗冻活性。此外，氨基酸的排列对其抗冻活性也有很大影响。具有抗冻活性的多肽通常具有三肽重复序列(-GIy-Z-X-) n，X是任何氨基酸残基，Z是脯氨酸或羟脯氨酸残基，SBPH的序列具有抗冻多肽的重复序列结构。利用Insilo方法预测各肽段的水溶性和不稳定性指数(指数越高表明蛋白水解物越不稳定)，结果表明，大多数短肽具有良好的水溶性和稳定性，这有利于多肽在食品加工和贮藏过程中保持其抗冻活性，这对SBPH在食品工业中的应用具有重要意义。

3、SBPH的抗冻活性分析

利用DSC研究不同SBPH的THA，并计算冰晶相对含量。如图2所示，在BSA(对照)组中，熔化部分的再结晶在温度下降后立即开始，放热峰立即出现，表明BSA溶液是非抗冻剂的标准蛋白，没有THA。与BSA的DSC曲线相比，SBPH的放热峰出现时间更晚，表明SBPH溶液表现出一定的热滞性质。由表4可知,SBPH具有一定的抗冻性能，THA为1.76。C，冰晶相对含量为24.60%。SBPH的THA与冰晶相对含量呈负相关。本研究制备的SBPH高于罗非鱼鳞片水解物的THA (0.37 °C) ,可能由于SBPH是混合物。本研究制备的SBPH高于鱼类抗冻蛋白的THA,具有很好的抗冻活性。

4、不同冷冻保护剂组的细胞生长能力曲线和细胞酸化活性分析

低温冷冻干燥处理后，生理盐水组的细菌生长对数期和稳定期明显延后，如图3所示。添加SBPH后，细菌的生长活性和细胞酸化活性均高于生理盐水组，其保护作用与甘油保护剂无明显差异，且水解物组的pH值低于其他处理组。随着培养时间的延长，各组的细胞生长能力曲线呈上升趋势，溶液的pH值呈下降趋势。与未冷冻细胞相比，水解物组在生长情况和细胞酸化活性方面仅有轻微的损失，说明SBPH对细胞的保护作用可与甘油等常用的冷冻保护剂媲美。

5、不同冷冻保护剂对冷冻处理后细胞存活率的影响

低温冷冻干燥处理后，各组细胞培养16 h后的生长情况如图4所示。冷冻处理前后的细胞存活率有明显差异，冷冻处理前的细胞OD_{600 nm}在1.12 ~ 1.15之间，冷冻干燥处理后，有冷冻保护剂组(蔗糖、脱脂牛乳、甘油组)的细胞存活率为64.60% ~ 80.70% ,水解物组的细胞存活率为(85.22+5.99) %，无冷冻保护剂(生理盐水组)的细胞存活率仅为(34.82+1.84) %。在SBPH的保护下，细胞的生长情况与甘油组无显著差异(P>0.05)，且冷冻保护作用显著高于其他处理组(P<0.05)。与其他冷冻保护剂相比，SBPH显著延缓了冷冻后细胞存活率的下降，SBPH对冷冻后的细胞具有显著的保护作用。

6、不同冷冻保护剂对MDA含量的影响

如图5所示，未冷冻过的细胞MDA含量为(1.52+0.09) μmol/L, 低温会使MDA产生积累，表明低温处理后细胞发生了明显的氧化应激，生理盐水组MDA含量( ( 3.72+0.17 ) μmol/L) 显著高于其他各组( P<0.05 )，蔗糖、脱脂牛乳和甘油组的MDA含量分别为( 2.89+0.16 )、( 2.96+0.12 ) μmol/L 和( 2.31 +0.18 ) μmol/L均高于水解物组( (2.21 +0.20) μmol/L)。结果表明，SBPH可提高细胞的抗冻能力，减轻低温对细胞造成的氧化应激损伤。

7、不同冷冻保护剂对细胞ATP酶活力的影响

如图6所示，未冷冻细胞的Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶的活力分别为(28.97 +0.39) U/mg和(25.80+0.58) U/mg ,在各冷冻保护剂的处理下，Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶的活力存在差异。在生理盐水处理组中，Na⁺-K⁺-ATP酶( ( 12.26+0.62) U/mg)和Ca²⁺-ATP酶((13.64+0.73) U/mg)活力在冷冻处理后与未冷冻组相比显著下降(P<0.05) 。水解物组的Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶的活力分别为(20.39+0.79) U/mg和(18.97+0.83) U/mg，其对于Na⁺-K⁺-ATP酶的保护作用显著高于蔗糖和甘油(P<0.05) ，对于Ca²⁺-ATP酶的保护作用显著高于蔗糖和脱脂牛乳(P<0.05)。结果表明，SBPH可抑制ATP酶活力的降低，帮助细胞在冷冻应激过程中调节离子浓度的动态平衡。

8、不同冷冻保护剂对细胞β-半乳糖苷酶活力和LDH活力的影响

由图7可知，未冷冻组的β-半乳糖苷酶活力为（17.03±0.53）U/mL，水解物、蔗糖、脱脂牛乳和甘油处理组的β-半乳糖苷酶活力分别为（15.15±0.39）、（13.49±0.68）、（11.04±0.81）U/mL和（14.96±0.50）U/mL，生理盐水组的β-半乳糖苷酶活力仅为（6.54±0.48）U/m L。冷冻会使β-半乳糖苷酶活力降低，SBPH和其他冷冻保护剂可减少细胞在冷冻过程中β-半乳糖苷酶活力的损失。加入SBPH的细胞β-半乳糖苷酶活力显著高于蔗糖和脱脂牛奶处理组（P＜0.05），SBPH的加入可保护细胞中的β-半乳糖苷酶活力，证明SBPH对低温冷冻下的细胞具有一定的保护作用。

冷冻处理后，生理盐水组细胞的LDH活力（（91.8±12.8）U/L）与未冷冻相比显著降低，在SBPH和冷冻保护剂的加入下，LDH活力均有所提升，对细胞中的LDH有保护作用。SBPH的加入使细胞的LDH活力维持在（271.4±18.2）U/L，SBPH与甘油对细胞LDH的保护作用无显著性差异（P＞0.05）。

综上所述，SBPH是一种有效的冷冻保护剂，可能是加入SBPH后，其与冰晶结合，减少了冰晶对细胞的破坏，进而延缓了细胞在冷冻过程中β-半乳糖苷酶和LDH活力的丧失。

9、不同冷冻保护剂对细胞代谢活性的影响

由图8可知，新鲜未冷冻细胞代谢活性为（96.04±1.35）%，冷冻后细胞代谢活性显著下降（P＜0.05），生理盐水组的代谢活性为（37.65±2.17）%。不同的冷冻保护剂均显著延缓了细胞代谢活性的降低，水解物、蔗糖、脱脂牛乳和甘油组的细胞代谢活性分别为（74.32±2.70）%、（51.39±1.58）%、（53.80±2.83）%和（70.65±3.40）%。结果表明，SBPH保护了细胞的代谢活性，延缓了细胞代谢活性的下降。

10、不同冷冻保护剂对细胞膜电势的影响

图9为加入不同冷冻保护剂后细胞膜电势的荧光谱图。冷冻处理之后，不同冷冻保护剂组细胞的探针荧光强度有相似的上升趋势。与未冷冻的细胞荧光强度（59.5）相比，冷冻处理后的细胞膜电位明显升高。生理盐水组探针的荧光强度最大（170.02±0.47）。相比之下，不同抗冻剂组探究的荧光强度均明显低于生理盐水组。水解物、蔗糖、脱脂牛乳和甘油组的荧光强度分别为82.69±0.51、113.26±0.35、137.59±0.40和86.59±0.39。冷冻处理会导致细胞膜电势升高，进而开放K+通道，K+的外流会导致膜电位的极化，这种极化在生理盐水组最为明显，因此探针的荧光强度增强。荧光强度表明，SBPH可维持细胞膜电势和离子通道的平衡，从而维持细胞代谢活性。

11、SBPH与大豆卵磷脂的FTIR分析

SBPH和大豆卵磷脂之间的相互作用如图10 所示。细胞膜界面的C＝O键的位置在1750～1650 cm-1之间，磷脂头中对称或不对称的P ＝O 键的位置在1260～1050 cm-1之间。冻干之后的大豆卵磷脂FTIR光谱相比大豆卵磷脂和SBPH混合物透过率更低。大豆卵磷脂FTIR光谱在3410、2917、1625、1255、1091 cm-1处的吸收峰，分别对应大豆卵磷脂中的亲水基与水分子形成的氢键、饱和碳C—H伸缩振动带、C＝O伸缩振动带、C—O和C—O—C振动带和P＝O伸缩振动带。随着SBPH的加入，大豆卵磷脂和SBPH在大豆卵磷脂在3410、2917、1625、1091 cm-1处的吸收峰强度增加，并且吸收峰发生偏移。大豆卵磷脂与多肽混合物（质量比1∶1）的吸收峰移至3411、2927、1643、1074 cm-1，大豆卵磷脂与多肽混合物（质量比1∶3）的吸收峰移至3417、2919、1645、1076 cm-1。SBPH的存在改变了FTIR图谱中的各峰值，影响了其功能位点，这些功能位点图谱的改变可反映SBPH与细胞膜的相互作用。在冷冻过程中，磷脂双分子层由流动的无序液体相转变为刚性有序的凝胶相，这种转变会对细胞膜造成极大的损害。SBPH的抗冻活性可能与其取代了水分子在生物膜结构中的位置有关。SBPH的—OH与磷脂头部基团之间的氢键可使磷脂头部相互靠近，进而降低磷脂的相变温度，进而稳定细胞膜的结构和生物功能。

结论

本研究利用碱性蛋白酶水解鱼糜加工副产物制得SBPH，产物具有较低的分子质量，表现出一定的抗冻活性，富含甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸，同时具有（-Gly-Z-X-）n三肽序列，这些都与SBPH的抗冻活性相关。SBPH可明显提高冷冻后细胞存活率、生长活性和细胞酸化活性，可减轻低温对细胞造成的氧化应激损伤，抑制ATP酶、β-半乳糖苷酶活力和LDH活力的下降，更好地维持细胞代谢活性，减轻细胞膜的超极化。SBPH的抗冻活性可能是通过其与细胞膜磷脂之间的相互作用来实现的。SBPH可作为一种新型抗冻剂，在益生菌和冷冻食品方面具有潜在用途，以减少冷冻造成的机械损伤。然而，还需要进一步对SBPH进行分离纯化，以得到活性组分，进而研究其对嗜热链球菌的冷冻保护机制。