炎症性肠病（IBD）可分为特异性炎性病变和非特异性炎性病变。溃疡性结肠炎（UC）属于IBD，是一种病因未明的自发性、慢性结肠黏膜炎症病变，临床症状主要表现为腹泻、黏液脓血便和腹痛，其发病机制目前尚未清楚。目前治疗UC的药物有5-氨基水杨酸和糖皮质激素等，然而这些药物会产生一定的副作用。因此，亟需寻求更有效和安全的食源性生物活性物质来预防结肠炎。植物胞外囊泡（ENs）在维持生物内环境稳态、预防疾病等方面具有重要作用。ENs经口服摄入后，通过囊泡运输机制到达小肠，被肠道吸收，具有维持肠道稳态等功能，不会引起特异性免疫等问题，有望用于预防结肠炎。

研究人员对20 种食性植物来源ENs抗炎活性进行筛选，发现大蒜（Allium sativum L.）来源ENs能调节脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中M1/M2型炎症因子的表达，下调肥胖小鼠空腹血糖和血清中胰岛素水平。南京财经大学廖柳月、朱珍珠*、杨倩等人对GENs所含脂质、蛋白质和核酸进行鉴定，通过体内外模型评估GENs对肠道屏障损伤的作用、抗炎活性和潜在的作用机制，旨在揭示GENs活性成分与其抗炎活性之间的关系，挖掘GENs对人体的健康益处，提升大蒜在食品应用中的附加值。

1.大蒜胞外囊泡的结构表征

如图1A所示，采用超速离心与蔗糖密度梯度离心法从蒜汁中提取胞外囊泡，在梯度蔗糖溶液中出现了3 个条带， 30%和45%蔗糖溶液界面间的沉降带含有GENs。TEM观察结果显示GENs为杯状囊泡，具有双层膜结构，直径在100～200 nm之间（图1B）。NTA数据显示，GENs粒径呈正态分布，平均粒径为（160.20±3.50）nm（图1C）。GENs在溶液中的平均水合粒径为（229.33±3.26）nm（图1D），ζ电位为（-10.07±0.78）mV（图1E），PDI小于0.30。

2.GENs的活性成分

基于LC-MS联用非靶向的方式对GENs脂质提取物进行检测，共鉴定出26 种脂质。其中，磷脂酰胆碱（PC）占比最高（27.68%），酰基己糖基谷甾醇酯、神经鞘磷脂和甘油三酯占比均超过10%（图2A），说明GENs含磷脂双分子层。表1显示了GENs总脂质中前10 种PC的丰度，其中PC（34:2）含量最高，占比17.06%。

由图2B可知，SDS-PAGE结果显示GENs含有的蛋白质分子质量主要分布在70 kDa以下。由于GENs中有关蛋白质种类的研究数据缺乏，本研究参考葱属（Allium）蛋白质序列数据库进行数据匹配，共鉴定出GENs含有62 种蛋白质，主要是胞质类蛋白（水通道蛋白等），还有蒜氨酸酶等，这些蛋白质分子质量主要集中在10～60 kDa（图2C）。对比分析发现，GENs含有13 种与韭菜来源ENs相同的蛋白质。其中，热休克蛋白70、腺苷同型半胱氨酸酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（表2）也是多种植物来源胞外囊泡鉴定出的标志蛋白。最新研究表明，内源性GAPDH参与外泌体的形成和分泌。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，加入GENs核酸提取物，在100～250 bp处出现明显的条带；由图2D可知，向核酸样品中加入核糖核酸酶A后，条带消失，说明GENs样品中含有RNA。对核酸提取物进行转录组测序分析，以核苷酸（nucleotide，nt）为单位，通过对长度在18～36 nt的Unique Reads序列进行统计分析，发现RNA长度主要集中在21 nt和22 nt（图2E），验证了核酸主要为miRNA。同时，共鉴定出257 个已知miRNA序列、60 个新miRNA序列。以该物种的mRNA序列为目标序列进行靶基因预测，发现GENs中的5 种miRNA可靶向编码人源基因，如白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）和肿瘤坏死因子（TNF）-α等（表3）。

3.GENs对Caco-2细胞生长的影响

MTT实验结果如图3A所示，GENs质量浓度在1～80 μg/mL范围内，Caco-2细胞的存活率均大于100%，说明GENs无细胞毒性，不影响细胞的正常生长。以空白组细胞存活率作为100%，LPS组细胞存活率大于90%。GENs处理后，当GENs质量浓度为1～20 μg/mL范围内，细胞存活率随GENs质量浓度增加而增加；当GENs质量浓度为40 μg/mL和80 μg/mL时，细胞存活率虽然有所下降，但是均大于100%（图3B），说明GENs在一定质量浓度范围内可减轻LPS对Caco-2细胞的损伤，促进细胞的生长，具有良好的生物相容性。

4.GENs对LPS诱导Caco-2细胞的抗炎活性

LPS经细胞膜上Toll样受体4（TLR4）识别，对宿主细胞进行刺激，可导致各种促炎因子的产生，造成肠上皮细胞通透性增加，产生炎症。荧光黄可作为渗透标志物用来评估Caco-2细胞单层通透性，空白组细胞的Papp为0.28×10^-6 cm/s，LPS刺激后，Papp显著增加；与LPS处理组相比，随着GENs质量浓度的增加，Papp极显著降低（图4A）。LPS会诱导一氧化氮合酶等促炎酶的过表达，导致NO的过度生成，触发炎症反应。本实验结果发现，GENs处理后细胞内NO生成量呈现质量浓度依赖性下调（图4B）。结果表明，GENs可缓解LPS对肠道屏障的损伤，这可能与GENs含有的脂质密切相关。PC是结肠黏膜屏障疏水表面的重要组成部分，可阻隔细菌和有害物质入侵。本研究发现PC在GENs脂质中占比最高，推测GENs可通过在黏膜边缘引入PC加强对肠道屏障的保护作用。

为了评估GENs的抗炎活性，进一步考察了GENs处理前后细胞内促炎因子的分泌水平。由图5可知，LPS组细胞外IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ的分泌量极显著高于空白组的分泌量；与LPS组相比，GENs处理组细胞外IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量显著下降；GENs也能抑制IL-1β的分泌，当GENs质量浓度为5 μg/mL时表现出极显著抑制效果。GENs（10 μg/mL）处理组细胞促炎因子分泌量高于GENs（5 μg/mL）处理组。结果表明，GENs在低质量浓度条件下可抑制Caco-2细胞促炎因子的过量分泌，表现出抗炎活性；GENs质量浓度增加，可能存在双向调节作用。

5.GENs体内毒性及其对DSS诱导小鼠结肠炎的影响

正常小鼠摄入不同剂量的GENs（20、100、500 mg/（kg m_b·d））在15 d内未出现死亡，存活率均为100%（图6A），说明GENs在所选实验质量浓度范围内对小鼠无毒性。DSS是一种带负电荷的多糖，可诱导小鼠肠上皮屏障破坏，允许腔内微生物进入黏膜，导致大量的炎症反应，释放促炎因子，出现结肠炎症状。DSS引起的结肠炎症状主要表现为腹泻、便血、体质量减轻、DAI评分增加、结肠长度缩短。如图6B所示，15 d后DSS组与对照组比较，体质量降低、血便严重、DAI评分极显著增加；GENs给药组体质量有所回升，血便程度降低，DAI评分与DSS组相比有所下降。其中，GENs中剂量处理组小鼠在第15天的DAI评分最低并与DSS组相比呈现极显著性差异，GENs高剂量处理组小鼠在第15天的DAI评分与DSS组小鼠的DAI评分无显著性差异。如图6C所示，GENs处理组小鼠的结肠长度相比于DSS组小鼠有所增加，其中GENs中剂量处理组小鼠结肠长度变化显著，说明摄入适量的GENs有效缓解了DSS给小鼠带来的病理反应。

6.GENs对DSS诱导小鼠结肠组织的影响

通过对结肠组织切片染色发现，对照组小鼠结肠组织的腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞未见减少，未见明显的炎性细胞浸润；DSS组小鼠结肠组织的腺体排列混乱，杯状细胞数量锐减，肠壁变厚、出现水肿，病变累及黏膜层和黏膜下层，存在大量的炎性细胞浸润（图7）。GENs给药后，DSS诱导的结肠组织病变有所改善。与DSS组相比，GENs低剂量组结肠组织的腺体排列较为规则，炎性细胞浸润减少；GENs中剂量组结肠组织的腺体排列规则，杯状细胞数量和隐窝形态较完好，未见明显水肿，炎性细胞浸润减少，肠壁厚度正常；GENs高剂量组结肠组织的腺体排列较为规则，炎性细胞浸润减少，肠壁水肿有所好转。病理学组织切片结果显示，摄入适量的GENs对DSS诱导的小鼠结肠炎有一定的改善作用。

如图8所示，与DSS组相比，低、中、高剂量GENs处理组小鼠血清中IL-6的分泌水平分别下调了32%、41%和35%。GENs处理后，血清中的TNF-α和IFN-γ分泌水平也有所降低，低剂量GENs处理效果较为显著。同时，与DSS处理组相比，低、中剂量GENs处理组小鼠血清中NO的产生量极显著降低。高剂量GENs处理组小鼠血清中IFN-γ和NO分泌量与DSS处理组的结果无显著差异。本实验结果表明，在一定剂量范围内，GENs可下调促炎因子的分泌水平，本实验中100 mg/（kg m_b·d）GENs处理效果最佳，能够显著抑制肠道炎症反应。

结论

本实验成功分离纯化得到大蒜胞外囊泡（GENs），通过多组学手段解析GENs的化学组成，它是含有26 种脂质、62 种蛋白质和317 种miRNA的纳米级外泌体样囊泡。其中，PC在脂质中含量最高，5 种miRNAs可靶向调控人体促炎因子表达。经体外实验发现，低质量浓度GENs能保护肠道屏障损伤，下调细胞内促炎因子过量分泌。体内实验表明，长期摄入适量的GENs能显著降低小鼠DAI，有效改善DSS引起的结肠长度缩短，抑制血清中促炎因子水平。GENs在体内外表现出的抗炎活性与其活性成分所起的作用密不可分。因此，GENs可能通过PC和特定miRNA共同作用，保护肠道屏障损伤，调节炎性介质分泌水平，有效缓解肠道细胞内炎症反应，预防结肠炎。大蒜目前还属于非模式植物，在常用蛋白质数据库中的可用性受到限制，未来的研究中，将继续探究GENs内蛋白质潜在的抗炎作用。本实验揭示了GENs的活性成分与抗炎活性之间的关系，可为大蒜衍生产品在抗结肠炎方面的应用提供理论参考。