食源性致病菌的生物被膜是固着在食品接触表面上形成的具有一定空间组织的多细胞群体结构。因生物被膜具有极强的黏附性和抗逆性，常规消杀手段难以对其进行有效防控，造成食品安全隐患并严重威胁消费者身体健康。据WHO报道，每年约有30%的食源性疾病是由病原微生物污染导致的，其中约65%都与食源性致病菌形成的生物被膜相关。针对食品接触表面食源性致病菌生物被膜形成机制的深入探索及相关新型防控方法的开发，已经成为食品安全领域的关注重点和研究热点。
上海理工大学健康科学与工程学院董庆利教授、吴梦洁、马悦*等在现阶段生物被膜形成机制的研究多集中于细菌个体和聚集体的形态及相关基因表达的变化方面的基础上，以生物被膜黏附性提高、菌体状态改变和抗逆性增强的3个主要特点为核心，总结归纳常见食源性致病菌生物被膜的形成机制。此文深入分析多种生物被膜防控方法的内在作用机制，在此基础上探讨各方法的优势及局限性。最后展望生物被膜领域未来的重点研究方向，旨在为制定食品领域的新型生物被膜防控策略提供参考，以期更好地保障食品安全和消费者健康。
01 食品接触表面的生物被膜
食品接触表面指在食品的生产、加工、销售及烹饪过程中，与食品直接或者间接接触的各种器具设备等物体的表面。食源性致病菌主要包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等都易定植于食品接触表面并发展为成熟的生物被膜。生物被膜的形成是一个复杂的动态过程，可分为5 个主要阶段，分别是可逆附着、不可逆附着、微菌落的形成、生物被膜的成熟及最终的分散阶段。
成熟的生物被膜会对食品加工效率和安全造成不利影响。普通的抗菌和清洁方法对其的作用十分有限。
02 生物被膜的形成机制
细菌长链附属结构增强特异性黏附
细菌对食品接触表面的特异性黏附通常依赖于其细胞表面可能存在丝状长链附属结构，例如鞭毛、菌毛、菌柄等。目前，关于细菌长链附属结构在生物被膜形成过程中的作用研究仍处于起步阶段，相关研究报道尚不多见。然而细菌长链附属结构通常具有高比表面积，与接触表面的黏附效应在生物被膜形成过程中的作用可能被严重低估。
群体感应系统调控细菌状态
AI-2是一种通用于革兰氏阴性菌(G-)和阳性菌 (G+)的信号分子，可实现细菌的种间交流，促进混合菌生物被膜的形成。如图1A所示，细菌胞内的S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS) 在活化甲基循环中可生成4,5-二羟基-2,3-戊二酮(DPD)，DPD通过自发的环化反应生成AI-2信号分子并通过自由扩散或YdgG蛋白转运至胞外。随着细菌的增殖，转运至胞外的AI-2信号分 子浓度逐渐增加，达到某一浓度阈值后，通过Lsr转运蛋 白重新进入细胞内，并在LsrK的作用下实现磷酸化，调节包括生物被膜形成在内的QS相关基因的表达，实现细菌种内或种间的交流。
如图1B所示，AHL是存在于大多数革兰氏阴性菌 (G-)的信号分子，其分子结由N-酰基高丝氨酸内酯环和一个含4~18个碳的酰基侧链构成。AHL由LuxI同源蛋白合成酶合成并通过自由扩散分泌至胞外，当达阈值浓度后，可与LuxR家族的受体蛋白结合，导致相关基因被抑制或激活。因此，菌体中是否具有完整的LuxI/LuxR同源蛋白系统，直接决定细菌可否通过AHL介导的QS进 行胞间交流。例如，部分大肠杆菌不能表达LuxI同源蛋白，因此无法合成AHL信号分子，但其胞内含有的LuxR 受体蛋白可与其他细菌合成的AHL信号分子结合并调控相关基因的表达，进而实现胞间交流。由此证明以 AHL介导的QS系统受到LuxI/LuxR的调控。
如图1C所示，革兰氏阳性菌(G+)的主要信号分子是修饰后的寡肽分子AIP。不同于AHL介导的QS系统，AIP分子无法通过自由扩散分泌至胞外，必须通过ABC转 运系统或者其他膜蛋白才能传递至胞外。当AIP达浓度阈值后，可与HK结合，使得HK受体被激活并进一步激活下游反应的RR，激活后的RR可以启动特定基因的转录， 从而实现细菌间的动态交流。 目前3种信号分子的合成及传递路径已较为清晰， 然而针对不同菌种的信号分子受体及相关基因的研究尚不完整。因此，针对不同种受体细菌在接收信号分子后，如何控制哪些相关基因从而调控生物被膜的形成仍需系统性研究。 细菌分泌的EPS通常由多糖类、蛋白质、核酸和脂类组成。其中蛋白质和多糖是EPS的主要成分，占EPS总量的75%～89%。在EPS环境下，细菌细胞和其他颗粒通过内聚力和黏附力紧密结合在一起。该形态一方面可减少外界不利条件对菌体的影响，例如，EPS形成的屏障可限制抗菌剂的扩散，且一些胞外蛋白或多糖可通过某些相互作用延迟或者阻止抗菌剂到达生物被膜内部的目标细菌，使得处于生物被膜状态下的细菌相较于浮游态细菌对杀菌剂的耐受能力更强。另一方面，细菌细胞分泌的信号分子可在EPS包裹的密闭环境下迅速累积至其浓度阈值，从而促进生物被膜环境下细菌细胞间的信息交流，加速形成生物被膜。由此可知，EPS基质在生物被膜形成过程中具有重要作用，然而不同生物被膜EPS中基本大分子的数量及分布特性对生物被膜形成过程中的相互作用和生物被膜抗逆性的影响尚不清晰，需进一步探究。03 生物被膜的防控方式
3.1 化学法防控生物被膜
化学法通常直接作用于浮游或生物被膜状态下的微生物，即通过使用具有抗菌功能的化合物或单质杀死活细菌。化学抗菌剂的投入既可以通过阻断致病菌的生长繁殖，预防生物被膜的产生，也可以通过杀死成熟生物被膜中的细菌，逐步裂解并清除生物被膜。然而，由于生物被膜结构的致密性及细菌在生物被膜中生存状态的复杂性，后者的作用效率较低。
化学抗菌剂通常可分为无机抗菌剂和有机抗菌剂两类。过氧化氢、次氯酸钠、二氧化氯是食品行业中最常使用的无机广谱抗菌剂。相较于无机杀菌剂，有机杀菌剂在食品领域的应用更为广泛，如过氧乙酸、季铵盐类、抗菌精油类和天然抗菌分子等。其中，壳聚糖及其衍生物是一种典型的季铵盐类抗菌剂，因具有的广谱抗菌性、无毒性、良好的生物降解性和生物相容性，在生物被膜的防治应用方面引起了广泛关注。对典型化学抗菌剂的总结见表1。
3.2 物理法防控生物被摸
机械法
机械处理即通过简单的刮擦、冲洗等去除食品接触表面的生物被膜。该方法适用性广、清洁效果较好，但是对生物被膜的清洁不彻底，极易在残存的生物被膜的基础上快速发展成新膜。 在食品行业中，通常使用低频（＜500 kHz）超声波作为防控致病菌生物被膜的手段，其作用机理可大致分为两个方面：杀菌效应和机械效应。超声波可通过热效应和产生自由基实现生物被膜环境下的杀菌功能。超声波的本质是一种机械波，引发的机械振荡也可以通过破坏生物被膜的基本结构移除生物被膜。然而，由超声波引发的单纯机械振荡对生物被膜的破坏效果非常有限，超声波对生物被膜控制作用主要依赖于其产生杀菌功能而不是机械效应。 3.3 生物法防控生物被摸
生物被膜破坏酶主要作用于生物被膜中的胞外物质，包括DNA、多糖及蛋白质等。其中氧化酶、多糖降解酶和蛋白水解酶由于其高效性和特异性，在生物被膜防控方面发挥着重要的作用。由于酶反应的特异性，不同的酶针对细胞基质中不同成分具有降解作用，将多种酶联合使用可在一定程度上提高抑制或清除生物被膜的效率。另外值得注意的是，生物被膜破坏酶的本质是蛋白质，为避免酶失活，应注意避免在高温、强酸或强碱等不利环境条件下使用此类生物被膜破坏酶。 在细菌形成生物被膜后，对常规抗菌剂的耐药性显著增强。噬菌体是一种可最终导致细菌细胞裂解的病毒，细菌对其抗性较弱，且相较于传统抗菌剂，其生产依靠于自身的繁殖，具有生产周期短、成本低、环境友好等特点，因此被认为是具有极大应用潜力的新型抗生物被膜制剂。尽管噬菌体在抗生物被膜的应用上表现出巨大的优势和前景，然而其作用宿主细菌范围狭窄、内毒素的释放及在生物被膜中的扩散效率较低等缺点是制约噬菌体作为抗生物被膜制剂在食品领域应用的主要原因。 不同于上述杀菌或移除胞外物的方式，群体感应系统（QS）抑制剂可通过抑制信号分子的合成、酶解信号分子和竞争性结合受体蛋白3种方式阻断细菌间的通讯，从而抑制生物被膜的形成（图2）。QS信号分子的产生需要相关酶的参与，因此可通过抑制酶的活性有效阻断信号分子的合成。当信号分子已经合成并分泌出胞外后，可以通过特定的酶 来破坏或改变信号分子结构，以阻断QS系统。此外，研究发现，一些信号分子结构类似物可通过氢键和疏水作用与信号分子的结合蛋白发生拮抗作用，通过占据结合位点或改变结合蛋白的分子构象，抑制信号分子传递通路。
3.4 多种方法联合防控生物被膜
单一的生物被膜处理手段带来的效果相对有限。因此，从生物被膜“物理结构破坏”、“化学降解”及“生物灭活”3个角度切入，结合多种处理方法作用于生物被膜的不同位点，可能形成协同效应，从而提高食源性致病菌生物被膜的预防及控制的效率。例如利用物理方法破坏生物被膜物理结构，使其结构变得松散，形成抗菌物质传递通道。此时，具有降解生物被膜基质的活性酶或抗菌剂等功能性分子可突破生物被膜基质形成的物理屏障，高效渗透扩散至生物被膜内部，提高降解或抗菌效率。表2总结了具有代表性的多种生物被膜防控法联合作用的例子。值得注意的是，生物防控法通常要求较为温和的环境条件，当其与其他控制手段联合使用时，可能存在拮抗效应。在多种防控手段联合作用时，各方法的使用顺序和剂量强度都应该系统探究，以实现协同效应的最大化。此外，当前联合法抗生物被膜的研究多注重于生物被膜清除效率总体的提高，而各个方法的贡献并无定量分析。因此对联合多种抗生物被膜方法后，是否存在协同效应及其强度大小的判断不准确。
在食品加生产、加工和销售的过程中，与食品直接或间接接触的材料表面极易黏附食源性致病菌，并在复杂的环境条件下逐渐形成具有极强抗逆性的生物被膜，对食品安全造成不利的影响，严重危害消费者的生命健康。近年来，针对生物被膜形成机制研究及防控手段的研发已成为食品安全及有害微生物防控领域的关注重点。然而由于生物被膜结构的复杂性、不同菌种生物被膜间的差异性及基底材料的多样性，生物被膜在食品接触表面的形成机制目前尚无清晰的定义。此外，针对生物被膜的防控技术及材料的研发仍依赖于对单一生物被膜组分作用效果的提升，而非对生物被膜复杂整体的把控。 第一，定量解析生物被膜组分及各组分对整个生物被膜系统抗逆性的影响规律。生物被膜是由多种胞外分泌物及不同状态的菌株组成，不同组分的理化性质、占比、活性及其相互作用可直接或间接影响整个细胞被膜结构表型及其抗逆特性。对各组分的系统研究是破译生物被膜独特抗逆特性的前提条件； 第二，研究在QS中不同细菌的信号分子相关基因及蛋白的动态调控网络。目前研究仅局限于部分细菌QS调控生物被膜形成的分子机制，不同调控系统间的相互作用尚不清晰。无法系统全面地解析在生物被膜独特环境下多种细菌活性调控，从而进一步揭示生物被膜形成的复杂机制； 第三，开发新型高效的生物被膜防控材料及技术。通过材料结构及功能设计，开发出多靶点作用的抗生物被膜材料，或将现有成熟的多种生物被膜防控技术进行组合，利用协同效应提高食源性致病菌生物被膜的防控效率，以减少由生物被膜污染造成的食品安全问题，保障消费者身体健康和生命安全。
