西南民族大学食品科学与技术学院唐善虎教授等：丙二醛氧化对牦牛肉肌原纤维蛋白结构及功能特性的影响
2023-06-19作者：来源：责任编辑：食品界
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牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、高不饱和脂肪酸含量等优良品质。高品质的牦牛肉在运输、加工与贮藏过程中蛋白质和脂质极易发生氧化，导致牦牛肉品质劣变。诸多证据表明脂质氧化产生的活性物质如自由基、氢过氧化物和次级产物可以与蛋白及其氧化产物相互作用，从而影响蛋白质的功能特性与营养价值。
研究发现，脂质氧化的次级产物比初级产物更容易与蛋白质相互作用。丙二醛是肉类加工、贮藏过程中脂质氧化次级产物中最丰富的活性醛类，来源于多种不饱和脂肪酸，具有较强的诱导蛋白氧化变性能力，是脂质氧化应激的标志物。目前，脂质氧化产物丙二醛对蛋白质氧化的影响仍存在争议，其氧化途径和机理仍不清楚，需要进一步研究。 西南民族大学陈腊梅，唐善虎*，李思宁等以牦牛肉完整体系中的肌原纤维蛋白（MP）为研究基础，向牦牛肉糜中分别加入0、0.1、1、5、10、20 mmol/L的丙二醛溶液，评价MP侧链氨基酸氧化、二三级结构以及凝胶特性和乳液稳定性的变化，探讨不同程度脂质氧化下牦牛肉MP的结构及功能变化规律，为进一步了解脂质氧化产物对蛋白质氧化的作用及其机制提供参考。 由图1可知，丙二醛浓度为0 mmol/L时，MP羰基含量为2.003 nmol/mg；而后各组羰基含量随丙二醛浓度增加整体呈显著升高趋势。说明丙二醛促进了蛋白质的羰基化。丙二醛通过与MP反应或直接氧化氨基酸侧链残基，导致MP羰基含量增加。
2、丙二醛氧化对牦牛肉丙二醛-MP加合物荧光强度的影响
由图2可知，丙二醛-MP加合物含量随着丙二醛浓度增加而显著增加，说明丙二醛促进了丙二醛-MP加合物的形成。丙二醛可以与蛋白质、氨基酸反应并交联形成Schiff碱、二氢吡啶类加合物等，其中Nε-(2-丙烯醛)赖氨酸是丙二醛与蛋白质共价结合的主要形式。当丙二醛未发生交联、游离醛基保留时，还有助于蛋白质羰基化形成。结合2.1节中MP羰基含量的增加结果，说明丙二醛与MP发生了加成反应，促进了MP羰基化，导致MP氧化。
由图3可知，经丙二醛氧化后，MP总巯基含量显著减少；丙二醛浓度达到10 mmol/L时，总巯基含量降到最低（50.641 nmol/mg）。当丙二醛浓度≥5 mmol/L时，总巯基含量变化不显著。这可能是因为较高脂质氧化程度下巯基已达到损失阈值，在亚油酸氧化MP中也观察到类似的趋势。4、丙二醛氧化对牦牛肉MP二聚酪氨酸含量的影响
由图4可知，丙二醛浓度（≤1 mmol/L）较小时，二聚酪氨酸含量无显著变化。随着丙二醛浓度增大（≥5 mmol/L），二聚酪氨酸含量开始显著增加。丙二醛氧化介导的肌红蛋白自氧化过程中会生成自由基、H2O2等活性物质，还会生成高价肌红蛋白等强促氧化剂，使酪氨酸侧链被攻击的几率增大，进而形成更多的酪氨酸自由基和酪氨酸残基，通过共价键与非共价键作用形成二聚酪氨酸，导致MP氧化。 
由图5可知，随着丙二醛浓度增加，MP表面疏水性呈先增强后减弱趋势。丙二醛浓度为0.1 mmol/L时，MP分子结构展开，表面疏水性显著增强；随着丙二醛浓度增加（≥1 mmol/L），MP过度暴露出的疏水基团可能经过不断氧化修饰，通过共价交联、疏水相互作用等途径形成氧化聚集体，导致MP表面疏水性减弱。6、丙二醛氧化对牦牛肉MP内源荧光强度的影响
由图6可知，色氨酸荧光强度随着丙二醛浓度的增大而逐渐降低，说明丙二醛促进了MP色氨酸的氧化。丙二醛在酸性条件下可与色氨酸残基的吲哚环发生反应，本研究中蛋白提取和溶解的缓冲溶液pH值偏酸性（pH 6.25、6.0），残留的丙二醛也可能与色氨酸侧链发生反应导致色氨酸荧光淬灭。此外，由于蛋白质聚集使暴露的色氨酸残基逐渐被埋入蛋白质分子内部，导致空间位阻增加，也会降低荧光强度。7、丙二醛氧化对牦牛肉MP二级结构的影响
由图7 可知，丙二醛氧化后的M P 谱图相似，在红外区具有若干特征吸收带，主要吸收峰都在1700～1500 cm－1，包括酰胺I带（1700～1600 cm－1）、酰胺II带（1650～1500 cm－1）。通过Peakfit 4.12对MP光谱图吸光度进行基线校正、去卷积、二阶求导和高斯拟合分析处理得到酰胺I带中β-转角（1700～1660 cm－1）、α-螺旋（1660～1651 cm －1）、无规卷曲（1650～1641 cm－1）和β-折叠（1640～1600 cm－1）的相对含量。
由图8可知，经丙二醛氧化后，牦牛肉MP的α-螺旋、β-折叠整体呈减少趋势，β-转角呈增加趋势，无规卷曲无显著变化。α-螺旋在低氧化水平下先向β-折叠和β-转角转化，随着丙二醛浓度增加，α-螺旋和β-折叠开始向β-转角转化，说明随着丙二醛氧化程度的增加，MP的结构从有序逐渐变为无序。
8、二醛氧化牦牛肉MP的SDS-PAGE分析
由图9 可知，MP中包含肌球蛋白重链（200、100 kDa）、副肌球蛋白（100 kDa）、肌动蛋白（43 kDa）、肌钙蛋白-T（35 kDa）以及肌球蛋白轻链（16～25 kDa）等成分。随着丙二醛浓度的增加，肌球蛋白重链、肌钙蛋白-T、肌球蛋白轻链条带均逐渐弱化；肌动蛋白无明显变化。其中，肌球蛋白损失最严重，说明在丙二醛氧化下增加的蛋白交联和肌球蛋白有较强的关联性。
9、丙二醛氧化对牦牛肉MP凝胶特性的影响
动态流变特性中G’和G”在25～85 ℃范围内的变化是探索蛋白质凝胶形成能力的主要手段之一。由图10a可知，丙二醛浓度0 mmol/L时，MP流变特性呈典型的G’曲线：48～55 ℃，G’逐渐上升，肌球蛋白开始变性，初步形成蛋白质网络结构；55～60 ℃，G’迅速下降，肌球蛋白尾部展开变性，导致现有网络结构破坏；60～85 ℃，G’稳定上升，肌球蛋白大量展开，肌球蛋白丝或复合物形成，蛋白质分子交联加强，形成稳定有序的三维网状结构。
由图10a可知，适当浓度的丙二醛（＜10 mmol/L）显著提高了MP的G’，其中丙二醛浓度为0.1 mmol/L时MP的G’最高，随着丙二醛浓度增加G’逐渐降低。10 mmol/L丙二醛氧化诱导的MP在热诱导后期的G’高于0 mmol/L；但丙二醛浓度为10～20 mmol/L时，MP并未出现凝胶形成的特征变化，此时形成的紧凑结构可能是蛋白质的聚合和聚集导致，而非三维网状结构。G”代表MP的凝胶黏性，图10b中G”的变化与G’相似，且G’始终高于G”，说明25～85 ℃热诱导下MP形成了一个更具弹性的蛋白凝胶。10、丙二醛氧化对牦牛肉MP乳液稳定性的影响
对MP乳液样品透射率图谱（图11）进行分析得到结果（表1）。由表1可知，经丙二醛氧化后，MP乳液的澄清指数、积分透射率、沉降速率均呈增大趋势，即MP乳液稳定性下降。蛋白质的氧化会影响界面膜的形成，降低其交联脂肪的能力，使MP乳液性能下降。经氧化后丙二醛与MP反应降低了MP表面疏水性，MP发生疏水性聚集，导致MP乳液不能形成稳定的界面膜，交联脂肪能力降低，使乳化稳定性下降。
11、丙二醛氧化对牦牛肉MP色泽的影响
脂质氧化是影响肉色的重要因素，主要研究了其对肌红蛋白的氧化影响；但MP是肉中占比最高的蛋白质，其色泽变化对肉色同样具有重要作用。由图12可知，经丙二醛氧化后MP颜色逐渐变黄，L*值无显著变化，b*值显著增大，a*显著减小后增大。b*值的增加可能是丙二醛诱导MP氧化导致蛋白羰基化严重以及丙二醛与氨基酸反应，导致棕色物质出现。说明脂质氧化对肉色有极大影响，且与MP的颜色变化存在关联。
通过建立丙二醛氧化体系模拟脂质氧化对牦牛肉糜中MP结构和功能特性的影响。研究发现，丙二醛与MP发生反应，促进了MP的氧化聚集，破坏了MP的结构稳定性，使MP更加无序，导致MP功能特性发生变化。适度的丙二醛氧化（＜10 mmol/L）整体提高了MP的G’、G”，有助于MP凝胶结构的形成，其中丙二醛浓度为0.1 mmol/L时MP的凝胶性能最佳。但过度氧化（≥10 mmol/L）会使MP高度聚集导致凝胶品质降低。然而，由于丙二醛氧化导致MP的交联聚集，MP乳液的澄清指数、积分透射率、沉降速率增大，MP乳液稳定性降低。此外，丙二醛氧化下MP的b*值增加色泽褐变，表明肉色褐变与脂质氧化、MP性质均存在关联。
本文《丙二醛氧化对牦牛肉肌原纤维蛋白结构及功能特性的影响》来源于《食品科学》2023年44卷08期46-54页，作者：陈腊梅，唐善虎*，李思宁，李锦锦，李巧艳，赵佳莹. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220627-299.
