食品界

J. Future Foods | 辣木叶提取物的降血糖作用及其基于网络药理学的机制预测

Introduction

糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，包括1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病（GDM）和其他类型的糖尿病。T2DM是成人中最常见的糖尿病，主要由胰岛素抵抗（IR）和β细胞功能障碍引起。近年来，糖尿病的患病率和发病率逐年上升。此外，糖尿病还可导致其他并发症，可损害眼睛、肾脏、心血管和神经系统，严重时甚至会导致器官衰竭，危及生命。目前，T2DM患者主要采用口服药物和胰岛素注射治疗，但长期用药会造成较大的副作用。因此，迫切需要天然且毒副作用小的糖尿病药物。

作为一种药用和食用资源，辣木叶含有多种生物活性成分，如黄酮类、多酚类、生物碱和异硫氰酸盐。虽然很多研究认为辣木叶具有良好的降血糖作用，但目前对辣木叶降血糖的主要成分和机制的研究还不够全面和系统。

网络药理学是一门结合系统生物学、生物信息学和网络科学的新兴学科。它系统地、整体地揭示药物的药理机制，分析药物与疾病的分子关系，开发新药。与传统的药物开发模式不同，网络药理学从综合角度研究多种疾病靶点与多种有效成分之间的相互作用，并筛选出有效成分、关键靶点和生物功能。

本研究首先研究了辣木叶提取物（MOLE）在体外的降血糖作用。接着，通过超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS）鉴定了MOLE中的化学成分。最后，利用网络药理学分析了MOLE中具有降血糖作用的主要活性成分、关键目标和作用机制。这些结果为深入研究MOLE的降血糖活性提供了数据支持。

Results and discussion

MOLE的体外降血糖活性

MOLE对胰岛素抵抗的HepG2细胞（IR-HepG2）的存活率如图1A所示，与正常对照组相比，胰岛素处理后HepG2细胞的存活率明显增加（P<0.05）。PA和Ins诱导建立IR模型后，与正常对照组相比，HepG2细胞的存活率没有明显差异，这表明Ins和PA对HepG2细胞没有毒性。此外，与模型组相比，不同剂量的MOLE干预组的细胞存活率无明显差异（P>0.05），说明MOLE对IR-HepG2细胞无毒性作用，可进一步开展实验。

HepG2细胞的葡萄糖消耗如图1B所示，与正常对照组相比，胰岛素处理后HepG2细胞的葡萄糖消耗量明显增加（P < 0.05）。然而，与正常组相比，经PA和Ins诱导后，葡萄糖消耗明显减少（P＜0.05），说明IR模型构建成功。此外，MOLE处理后，IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗明显增加，说明MOLE可以改善IR-HepG2细胞的IR。

图1 辣木叶提取物（MOLE）对IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗的缓解作用。（A）MOLE对IR-HepG2细胞活力的影响。(B) MOLE对IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗的影响。

UHPLC-MS分析

MOLE的总离子色谱图显示了所有化合物的化学组成（图2A）。共鉴定出976个化合物，包括60种类型的化合物，包括嘌呤核苷、核苷酸及其衍生物、黄酮类、黄酮类和生物碱。值得注意的是，相对含量最高的200个化合物占总化合物的92.03%，所以选择相对含量最高的200个化合物进行进一步分析。这些化合物主要分为嘌呤核苷酸、核苷酸及其衍生物和生物碱类（图2B）。

图2. 超高效液相色谱-质谱分析MOLE的化学成分。(A) 检测MOLE成分的总离子色谱图。(B)MOLE相对含量前200名成分的分类比例。

MOLE活性成分和疾病靶点预测

为了明确MOLE中主要化合物的疾病靶点，我们通过Swiss靶点预测数据库进行了靶点预测。对预测结果中可能值大于0.15的相关靶点进行整理，并删除重复的靶点，得到225个成分-靶点。对于2型糖尿病相关靶点，利用DisGeNET、Drugbank、OMIM和GeneCards数据库，分别用中位法筛选出3 832、40、452和6 797个靶点。在去除重复的靶点后，从中得到8 180个与2型糖尿病有关的靶点。对疾病靶点和预测的成分靶点进行交叉分析（图3），得出213个交集靶点和79个成分。

图3. MOLE和T2DM疾病目标的活性成分的维恩图。黄色代表MOLE成分目标，蓝色代表T2DM疾病目标，中间的颜色代表这两个目标的交点。

化合物-靶点网络

为了可视化成分和目标之间的相互作用，将交叉目标和可能涉及的成分导入Cytoscape 3.8.2软件中。构建了一个成分-疾病靶点相互作用网络，有305个节点和560条边连接（图4A）。使用Cytoscape的 " Network Analyzer "插件对网络的拓扑结构进行了分析。排名前3位的活性成分包括洋槐黄素、2',3,5,7-四羟基黄酮和异槲皮素（图4B）。其中，自由度最高的是洋槐黄素（自由度=97），表明洋槐黄素可能有较好的降血糖效果。黄酮类化合物洋槐黄素被研究证实具有良好的生物活性，包括抗病毒和抗氧化。然而，关于洋槐黄素的降糖作用的研究报道很少。考虑到其抗氧化性能可能对多种自由基介导的疾病提供保护，洋槐素可能具有良好的降血糖潜力，这需要进一步评估。

图4. 构建MOLE活性成分-T2DM疾病靶点基因网络。(A) MOLE成分-T2DM靶点相互作用网络图。(B)前7个自由度中的关键活性成分。

PPI网络

为了分析目标的相互作用，将213个相交的目标导入STRING，在 "物种 "中选择 " Homo sapiens "来构建PPI网络，得到了1 891条边（图5A）。PPI网络被导入Cytoscape软件进行进一步的分析和打分，产生了如图5B的分子网络图。对每个目标进行统计分析，提取出相互作用最强的PPI子网络（图5C）。自由度超过40的靶点包括AKT1、GAPDH、SRC、MAPK3、VEGFA、ESR1、PPARG、EGFR、PTGS2、MMP9、EP300、TLR4、PPARA和APP（图5D），意味着这些靶点在网络中发挥了重要作用。

图5. 蛋白质-蛋白质相互作用网络。(A) STRING数据库中交叉目标的PPI网络图。(B) Cytoscape软件中的目标蛋白相互作用网络。(C) 通过PPI筛选得到的最强相互作用子网络。(D) 程度大于40的目标的直方图。

GO和KEGG富集分析

图6A中分别列出了富集度最高的前10个GO术语。在BP类别中，目标蛋白分子主要参与RNA聚合酶II启动子转录的正向调节、信号转导、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的正向调节、细胞对胰岛素刺激的反应、葡萄糖平衡、葡萄糖导入的正向调节和胰岛素受体信号传导途径。

图6B显示，关键基因在8条信号通路中明显富集，包括PI3K-Akt信号通路、糖尿病心肌病、IR、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、胰岛素信号通路和T2DM，与低血糖有关。根据富集率，PI3K-Akt信号通路是MOLE中最重要的低血糖信号通路，其关键基因包括AKT1、MAPK3、VEGFA、EGFR、GSK3B、SYK、FLT3、INSR、PIK3R1、FGF1、FGF2、PIK3CG、PTK2、IGF1R，与PPI网络中得到的关键基因高度重合。作为葡萄糖代谢和胰岛素相关信号转导的主要调节者，大量研究证实PI3K-Akt信号通路的缺陷可以导致IR。因此，PI3K-Akt信号通路可能是MOLE发挥其降血糖作用的信号通路。

图6. 关键靶点的GO和KEGG富集度分析。(A) GO显示BP、CC和MF的前10个GO术语（P < 0.05）。(B）KEGG富集分析前20个信号通路（P＜0.05）。

Conclusion

本研究采用网络药理学的方法，系统地探讨了MOLE的生物活性成分及其降血糖机制。作者证实MOLE对IR-HepG2细胞有降糖作用。网络药理学分析表明，MOLE的保护作用可能与洋槐黄素有关，MOLE可能通过参与PI3K-Akt信号通路发挥降糖作用。MOLE是天然有效药物的一个潜在来源，可用于干预或辅助干预2型糖尿病。然而，这仅仅是一门理论科学，MOLE的关键成分和靶点的作用和功能值得在未来的实验中进一步深入研究。

第一作者

弘子姗，女，现云南农业大学食品科学技术学院食品科学与工程专业在读博士。主要研究方向：植物源多肽功能活性研究。主持云南省教育厅项目2项，参与国家重点研发计划、国家自然科学基金、云南省科技厅农业联合专项等多项，在国内外期刊公开发表学术论文13篇，第一作者论文9篇，其中SCI收录1篇。授权国家发明专利1件。

解静，女，云南农业大学食品科学技术学院副教授，硕士生导师，主要从事食药同源资源天然产物功效机制研究。主持项目8项，其中省部级项目3项，地厅级项目4项，校级项目1项，参与云南省科技厅重大科技专项计划等9个科研项目。以第一和共同通讯作者在Mol Nutr Food Res、Front Pharmacol、Front Cell Dev Biol等国内外期刊发表高质量学术论文12篇，其中SCI论文8篇（IF＞5，6篇），中文核心期刊论文4篇。获软件著作权1项。参编专著2本。

通信作者

田洋，博士，教授，博士生导师，食药同源资源开发与利用教育部工程技术研究中心主任。主要从事食药同源资源加工与高值化利用研究，主持国家自然科学基金、省重大科技专项等科研项目10余项；发表论文160余篇，以第一或通讯作者在Molecular Plant等国际权威期刊发表SCI论文30篇；编著著作5部；制定国家或行业标准6项；授权国家专利41件。获云南省科技进步一等奖1项，三等奖2项，梁希林业科技进步三等奖1项，云南省青年科技奖1项。先后入选国家现代农业产业技术体系岗位科学家、神农青年英才支持计划、云南省中青年学术和技术带头人、云南省产业科技领军人才、云南省食药同源功能性食品创新团队团队带头人。

盛军，博士，教授，博士生导师。主要从事生物技术研究和开发工作。承担国家863计划项目1项，国家、省部级课题10余项，申请国际和国内发明专利40余项，获国家发明专利10项，发表论文200余篇。获2017年云南省科学技术进步特等奖，2018年云南省科学技术杰出贡献奖，2019年云南省科学技术进步奖一等奖。曾入选“中国优秀青年科技创新奖”，首批“跨世纪百千万人才工程”国家级人选，云南省引进的首批“百名海外高层次人才”。2010年被评为“全国优秀科技工作者”，2014年获“云岭学者”称号。兼任中国微生物学会副理事长、国家科技进步奖评审专家、国家药监局新药评审专家。

Hypoglycemic effect of Moringa oleifera leaf extract and its mechanism prediction based on network pharmacology

Zishan Hong^a,b,c,1, Jing Xie^a,b,d,1, Huili Hu^a,d,1, Yuying Bai^a,c, Xia Hu^a,b, Tingting Li^a,b,d, Jinlian Chen^a,c,d, Jun Sheng^a,e,*, Yang Tian^a,b,c,d,^*

^a College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

^b National Research and Development Professional Center for Moringa Processing Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

^c Yunnan Provincial Engineering Research Center for Edible and Medicinal Homologous Functional Food, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

^d Engineering Research Center of Development and Utilization of Food and Drug Homologous Resources, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

^e Key Laboratory of Pu-er Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

¹ These authors contribute equally to the manuscript.

*Corresponding authors.

Abstract

HDiabetes mellitus (DM) is a chronic metabolic disease characterized by hyperglycemia, which poses a serious threat to human health. Moringa oleifera Lam is a medicinal and edible plant with various physiological functions. However, its main hypoglycemic components and mechanisms are still unclear. In this study, network pharmacology and bioinformatics were used to analyze the potential bioactive substances of M. oleifera leaf extract (MOLE) and its hypoglycemic mechanism. Studies have shown that MOLE has the effect of increasing glucose consumption in insulin resistant-HepG2 cells. MOLE was found to contain 975 compounds by ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS). Network pharmacology analysis indicated that the main active component was robinetin and the identified core genes were AKT1 and GAPDH. KEGG pathway enrichment analysis showed that the hypoglycemic effect of MOLE may be closely related to the PI3K-Akt signaling pathway. This study revealed the possible active components and mechanisms of action of M. oleifera for hypoglycemia, laying the theoretical foundation for subsequent studies.

Reference:

HONG Z S, XIE J, HU H L, et al. Hypoglycemic effect of Moringa oleifera leaf extract and its mechanism prediction based on network pharmacology[J]. Journal of Future Foods, 2023, 3(4): 383-391. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.03.009.