食品界

湖北工业大学汪超教授等：β-葡聚糖酶降解魔芋葡甘聚糖产物的制备及结构表征

魔芋葡甘聚糖（KGM）是从魔芋块茎中提取的水溶性天然多糖，是由D-葡萄糖和D-甘露糖按1∶1.6比例以β-1,4糖苷键连接的杂多糖，具有良好的凝胶性、持水性、增稠性和较高的营养价值，同时还拥有优异的结肠靶向传输能力，因而在食品加工领域受到广泛关注。研究发现，KGM降解产物具有更低的分子质量，可改善免疫调节、抗氧化以及促进益生菌生长等生物学功能。目前，食品工业中主要通过化学改性和生物改性等方法，通过引入新的基团或者改变原有的基团使其性质发生改变，从而对KGM进行改性。

湖北工业大学生物工程与食品学院的阙凤、汪超^*和湖北省农业科学院的吴文锦^*等人采用β-葡聚糖酶降低KGM分子质量以改善其理化性质，通过改变酶解时间、酶解用量探究酶解条件对KGM降解后产物结构和性质的影响，旨在为扩大KGM降解产物的应用范围提供一定理论依据。

1、β-葡聚糖酶降解KGM产物特性分析

由图1A可知，随着酶解时间延长，KGM酶解产物的分子质量显著降低（P＜0.05）；随着酶量的增加，分子质量显著下降（P＜0.05）。多重分散性（mw/mn）为1.059～1.39，表明KGM酶解产物的分子质量分布均匀。KGM几乎是目前多糖中特性黏度最高的一种天然多糖，原料KGM经过5倍酶量（0.3%，m/m）酶解120 min后的特征黏度从（1832.00±2.29）dL/g下降到（36.02±0.67）dL/g，产物的特征黏度随其分子质量减小而逐渐降低。如图1B所示，K₁、K₂、K₃、K₄脱乙酰度分别为（3.803±0.009）%、（6.616±0.004）%、（7.966±0.008）%、（8.702±0.003）%。脱乙酰度随着酶解KGM分子质量的减少以及其特性黏度的减小而增加。KGM分子结构中乙酰基的存在会抑制分子内和分子间氢键的形成。所以，随着KGM脱乙酰度的增大，其分子间和分子内的氢键作用会增强，空间效应提升，溶解度随之上升。甘露糖结构上的乙酰基残基是KGM中唯一存在的非糖官能团，这可能是葡甘聚糖的一个功能域，乙酰基团的变化影响KGM持水性的强弱。随着酶解时间的延长以及酶用量的增加，KGM分子脱乙酰度增强，这表明β-葡聚糖酶降解KGM能增强KGM分子间的相互作用。

2、β-葡聚糖酶降解KGM产物的总糖分析

如图2所示，原料KGM的可溶性总糖质量分数为（92.79±0.09）%，K₁、K₂、K₃、K₄的可溶性总糖质量分数分别为（86.72±1.07）%、（92.16±1.65）%、（90.62±0.57）%、（86.48±0.67）%。与原料KGM相比，K₁可溶性总糖含量有所下降，可能是酶解过程中KGM发生降解，糖苷键断裂，产生小分子物质（单糖、酸、醛等）。而K₂和K₃可溶性总糖含量高于K₁，可能是酶水解使一些不溶性的纤维素得以降解，从而增加了可溶性糖的含量。增加酶的用量后，K₄可溶性总糖含量显著下降（P＜0.05）。一般来说，经酶解处理后，KGM的糖苷键会发生变化，从而产生少量还原糖或者使带有还原性多糖的基团暴露。当酶用量过高时，可能存在酶的竞争抑制作用，酶解效果降低，从而导致还原糖含量下降，因此K₄可溶性总糖含量显著降低。

3、β-葡聚糖酶降解KGM产物的电学特性分析

如图3所示，原料KGM的Zeta电位值为（－10.58±0.50）mV，K₁、K₂、K₃、K₄的Zeta电位值分别为（－11.67±1.64）、（－12.32±1.61）、（－11.87±1.47）、（－7.49±1.00）mV。与原料KGM相比，K₁、K₂、K₃的Zeta电位绝对值有不同程度的提高，表明经β-葡聚糖酶水解后KGM糖单元C-6上的O—H基团发生交联，KGM的再溶解或分散可以抵抗分子间的聚集，排斥力大于分子间的吸引力。K₄的Zeta电位绝对值显著低于原料KGM（P＜0.05），Zeta电位与乙酰基的取代度有关，乙酰基可以在溶液中提供负电荷。酶解达到一定程度时，分子高度支化，水溶性黏度较低，多糖所带电荷减弱。

4、β-葡聚糖酶降解KGM产物的形貌及色泽分析

如图4所示，原料KGM呈粉末状且色泽偏黄，KGM酶解产物呈不规则形状，且表观色泽变白，各组KGM酶解产物的外观形态存在一定差异。其中，K₄得到产物的形态较其他酶解产物有一定差异，呈现出絮状粉末的形态。为详细分析酶解产物颜色的变化，利用色差仪对KGM及其酶解产物进行分析。由表1可知，酶解产物的L^*值和白度逐渐提升；与原料KGM相比，K₄的L^*值显著增加（P＜0.05）。这说明随着酶解时间的延长以及酶量的增加，KGM酶解产物的L^*值也相应增加。酶解改性减小KGM分子质量的同时，对其色泽有显著提高。

5、β-葡聚糖酶降解KGM产物的微观结构分析

如图5所示，原料KGM呈现出颗粒结构，KGM酶解产物呈现片层、丝状结构。K₁、K₂、K₃均有较显著的网络状结构。其中，K₂丝状结构的连接较为模糊，视野内保留部分片层结构；K3网络间的连接清晰，孔径不均匀。酶解产物中微观孔洞可能是由于氢键的解离或在该过程中水解处理后大分子链的降解所造成，氢键是维持KGM紧密排布的重要因素。相比之下，K₄微观结构最松散且丝状结构部分破坏；与K₂相比，酶用量的增加使其形态表现出比较粗糙的表面且表面细碎松散，可能是酶解处理KGM过程中，其分子内和分子间的氢键被破坏所导致，片状结构断裂，逐渐粉末化，分子质量进一步减小，促进了样品的溶解性。

6、β-葡聚糖酶降解KGM产物的特征峰分析

如图6所示，原料KGM及酶解KGM均检测到葡聚糖分子内的特定化学键：O—H拉伸（3500cm^－1）、C—H拉伸（2900cm^－1）、C＝O伸展（1627cm^－1），且C—O—C糖苷键拉伸振动（1180～930cm^－1）变化明显，这可能是降解后的KGM分子质量减小，可能出现β-糖苷键。1425～1729.6cm^－1处C＝O伸缩振动峰强度随脱乙酰度的增加逐渐升高，3434.5cm^－1处峰强度略微增强，表明形成的O—H增强，O—H伸缩振动随KGM分子质量减小略微展宽，这可能是由于原料KGM中乙酰基含量极少，暴露出的—OH含量少的原因。酶解产物的其余吸收峰无明显变化，这表明酶解KGM的分子主链结构不会因为降解而改变。

7、β-葡聚糖酶降解KGM产物的晶体结构分析

如图7所示，各组样品均在2θ 20°附近出现一个较大的弥散峰，仅衍射峰的位置和峰强度有细微差别，表明酶解处理后脱乙酰对KGM晶体结构的影响只发生在极小的范围内。酶解KGM样品结构与原料KGM类似，呈无定形态，表明分子相互作用较弱，分子排列较为松散，这是因为KGM由两种链段上带有乙酰基的单糖连接而成，使得分子链空间结构的完整性缺乏，其结晶特性可归纳为：长程无序，短程有序。与原料KGM相比，酶解KGM样品中去乙酰化作用使2θ 20°处的峰强度略有增加，KGM与KOGM之间的结构位置和强度有较细微的区别。K4在2θ 10°左右出现了一个新的弱衍射峰，可能是酶用量的增加导致酶解程度进一步增加，脱乙酰度增大，分子间分子内氢键作用增强，从而使结构发生改变，衍射峰偏移。

8、结论

本文研究了酶解时间和加酶量对于β-葡聚糖酶改性KGM的影响，探讨了不同酶解产物之间理化性质和生物活性与分子质量之间的关系。结果表明：β-葡聚糖酶改性可降解KGM，生成分子质量更低的酶解产物。与原料KGM相比，酶解产物具有更低的特征黏度和更高的脱乙酰度，并且红外光谱中1425～1729.6 cm^－1处C＝O伸缩振动峰增强，这表明β-葡聚糖酶降解能增强KGM分子间的相互作用；可溶性总糖含量有所下降，白度上升，表明KGM发生降解，并且β-葡聚糖酶改性处理对KGM的色泽还有一定的改善作用；而X射线衍射图则显示，一定程度的β-葡聚糖酶改性处理对KGM的晶体结构无显著影响，主链结构不发生改变，但通过添加5倍酶量对KGM进行酶解120 min处理，KGM降解产物则表现出较大程度晶体结构的改变。此外，研究发现对KGM进行5倍酶量酶解120 min后，所得酶解产物的分子质量显著低于原料KGM（P＜0.05），其特征黏度最小并且脱乙酰度最高，可能是通过抑制分子间氢键或提供空间位阻阻碍链堆积的乙酰基赋予KGM酶解产物溶解性，同时扫描电子显微镜结果说明脱乙酰化对KGM的微观结构具有一定的破坏作用，且Zeta电位测定结果说明此时得到的降解产物较不稳定。酶解产物的变化主要集中在宏观结构和分子质量等方面，Ma Shuping等的研究表明，不同分子质量的KGM吸水能力不同，能够固定淀粉凝胶中相邻的水分子，减少冻融淀粉的脱水收缩。高度脱乙酰度的KOGM空间位阻减少，促进了与肌球蛋白的糖化反应，从而改善了肌球蛋白的功能性。相比于天然KGM，较低分子质量的KGM酶解产物可以更容易地通过盲肠结肠，被结肠细菌发酵。

鉴于以上问题，未来应深入探讨β-葡聚糖酶酶解KGM的过程，了解其酶解机制，以期能够得到更稳定且微观结构更好的酶解产物，为食品工业中对KGM的高价值化利用提供理论依据。

本文《β-葡聚糖酶降解魔芋葡甘聚糖产物的制备及结构表征》来源于《食品科学》2023年44卷8期9-15页，作者：阙凤，夏雨婷，高天麒，汪超，汪兰，熊光权，石柳，丁安子，吴文锦。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220801-004.