食品界

《食品科学》：山西大学生物技术研究所李彬春副教授等：鼠李糖乳杆菌LGG芳香酯酶的酶学表征与结构分析

酯酶包括羧酸酯酶[EC 3.1.1.1]和芳香酯酶[EC 3.1.1.2]，催化酯键的断裂与形成，如水解、醇解和转酯反应。酯酶属于α/β水解酶超家族，微生物酯酶因其特殊的酶学性质如立体选择性、底物特异性、热稳定性、有机溶剂抗性和盐耐受性被广泛应用于诸多领域，已成为一类重要的生物技术用酶。

乳酸菌作为微生物酯酶主要来源之一，乳酸菌酯酶可催化产生多种短链酯、酚醇和脂肪酸而在发酵食品生产中起重要作用。鼠李糖乳杆菌（LGG）耐酸耐胆盐，能在人体肠道内定植，具有调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿以及提升机体免疫力等多重生理功效，已被广泛应用于多种益生菌产品。本实验室前期从鼠李糖乳杆菌LGG获得的芳香酯酶LggEst（与酯酶AA7的氨基酸序列相同）偏好水解中链对硝基苯酚酯，其最适反应pH值呈酸性且活性pH值范围较窄，挖掘酶学性质新颖的益生菌酯酶对于丰富益生菌酯酶库和扩展益生菌酯酶应用范围具有重要意义。

山西大学大型科学仪器中心的李新锋、山西大学生物技术研究所的郭彤彤、李彬春*等人聚焦于益生菌鼠李糖乳杆菌LGG，通过基因组信息挖掘策略，克隆获得新型芳香酯酶，对其酶学性质进行系统表征，旨在挖掘在食品领域具有潜在应用潜力的酯酶资源，并进行三级结构分析。

1.芳香酯酶的基因克隆与表达纯化

芳香酯酶的基因克隆

第3代益生菌鼠李糖乳杆菌LGG的基因组已被解析，基因组信息分析（GenBank序列号：FM179322.1）揭示其基因组包含7 个功能被注释为酯酶的基因，其中酯酶LGG_00941和LGG_02908在鼠李糖乳杆菌HN001中同源酶的晶体结构已得以解析，LGG_02908（LggEst）已被克隆表征，本研究关注于酯酶LGG_00941，将其命名为LggAE，由244 个氨基酸残基组成，对应由735 bp基因序列编码，以鼠李糖乳杆菌LGG基因组作为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示获得大小约为750 bp的单一条带，如图1所示，与目的基因LggAE大小相符，表明成功扩增获得目的基因LggAE。

使用pET-28a通用引物T7和T7-terminal作为上下游引物，以连接产物转化DH5α菌落溶于灭菌双蒸水作为模板，进行菌落PCR鉴定，如图2所示，阳性克隆在大小约1000 bp处存在单一条带，表明5 个克隆均为阳性克隆，送样测序验证，测序结果显示插入基因LggAE的核苷酸序列与其理论序列一致，表明目的基因LggAE成功克隆至载体pET-28a。

芳香酯酶异源表达与亲和纯化

芳香酯酶LggAE大肠杆菌工程菌经低温诱导表达，超声波破碎低温高速离心后，SDS-PAGE分析上清粗酶液和沉淀，如图3所示，在LggAE理论分子质量大小29.1 kDa处存在蛋白条带，少部分以可溶性形式表达于上清液中，大部分以包涵体状态存在于沉淀，基于LggAE在N-末端携带有组氨酸标签，因此利用镍柱亲和纯化目的酶，纯化后的LggAE纯度高，可以进一步酶学性质表征。

2.芳香酯酶的酶学性质

芳香酯酶的最适反应pH值与最适反应温度

图4显示，LggAE的最适反应pH值为7.5，LggAE虽来源于乳酸细菌，但其在中性及碱性p H 值范围（7.0～10.0）内表现出较高活性（＞75%），即使在pH 10.5条件下仍具有54.9%酶活力，LggAE在酸性pH值条件下具有较低酶活力，尤其pH值低于6.0时。然而，许多乳杆菌酯酶仅在很窄pH值范围内展现较高酶活力，同样来源于鼠李糖乳杆菌LGG的芳香酯酶LggEst，其最适反应pH值为6.5且在碱性条件下酶活力较低。

如图5所示，芳香酯酶LggAE的最适反应温度为50 ℃，在35～60 ℃较宽温度范围内均表现出较高催化活性（＞70%），即使在低温20 ℃和高温65 ℃条件下，LggAE仍能保持32%和38%的酶活力。

芳香酯酶的酶动力学分析与酰基链长选择性

如表2所示，芳香酯酶LggAE可以催化水解一系列不同酰基链长的对硝基苯酚酯，但对中短链对硝基苯酚酯（pNPC2～pNPC8）的酶活力更高，最大反应速率Vmax保持在10.0～20.2 U/mg，其中对pNPC6酶活力最高，转化数kcat为9.8 s－1；LggAE对不同酰基链长的芳香酯展示出不同的亲和力，LggAE对pNPC12的亲和力最好，米氏常数KM为2.0 µmol/L；催化效率kcat/KM显示LggAE偏好水解中链长酰基对硝基苯酚酯，LggAE的最适底物为pNPC8，催化效率为0.31 L/（µmol·s），然而，大多数乳杆菌酯酶偏好短链芳香酯，最适底物为pNPC2或pNPC4。

芳香酯酶的热稳定性

良好的热稳定性对于酯酶的开发应用至关重要，不同温度下的热失活曲线（图6）显示芳香酯酶LggAE仅在40 ℃下展现出一定的热稳定性，在40 ℃条件下保温30 min后仍保留48.6%酶活力，1 h后残余24.1%酶活力，LggAE在温度45 ℃和50 ℃下热稳定性较差，在45 ℃保温20 min和50 ℃保温10 min即几乎失活。

芳香酯酶的有机溶剂抗性

有机溶剂对于酯酶的催化反应至关重要，尤其是醇解和转酯反应，因此探究芳香酯酶对不同有机溶剂的抗性对于挖掘其应用潜力具有重要意义。如图7所示，乙二醇可以激活芳香酯酶LggAE活力，20%乙二醇促使酶活力增加了17.3%，二甲基亚砜对LggAE的酶活力几乎没有影响，然而，其他有机溶剂均抑制LggAE的酶活力，特别是乙腈、丙酮、20%异丙醇和20%乙醇显著抑制LggAE的酶活力。

芳香酯酶的盐浓度耐受性

为了评价芳香酯酶LggAE在食品领域中的应用潜力，探究了芳香酯酶LggAE在不同浓度柠檬酸钠和氯化钠存在下的活力，如表3所示，高浓度柠檬酸钠和氯化钠均抑制芳香酯酶LggAE活力，但LggAE对0.25～0.5 mol/L柠檬酸钠具有一定的耐受性，保持39.1%～45.8%酶活力，更高浓度柠檬酸钠显著抑制LggAE的酶活力，在0.8 mol/L条件下LggAE仅具有4.2%酶活力。LggAE对氯化钠的耐受性相对更高，在0.5 mol/L氯化钠条件下，LggAE保持71.0%酶活力，即使在1.0 mol/L氯化钠条件下，LggAE仍能保持53.7%酶活力，但不适合在更高浓度氯化钠存在下作为生物催化剂使用，已报道大多乳杆菌酯酶是耐盐甚至是盐激活的。

芳香酯酶的表面活性剂耐受性

如图8所示，芳香酯酶LggAE耐受0.1%非离子型表面活性剂吐温20、吐温80和曲拉通X-100，仍能保持44.0%～60.8%酶活力，但0.5%非离子型表面活性剂对LggAE的酶活力具有较强抑制作用，与吐温20相比，吐温80和曲拉通X-100对芳香酯酶的抑制作用更强。另一方面，离子型表面活性剂DOC抑制芳香酯酶LggAE的酶活力。

如图9所示，不同温度下DOC对LggAE酶活力的抑制程度不同，低温时DOC几乎不影响酶活力，但随着温度升高，DOC对酶活力的抑制作用增强，60 ℃时酶活力所剩无几，65 ℃时DOC使LggAE已完全失活，然而，对于同样来源于鼠李糖乳杆菌LGG的芳香酯酶LggEst，DOC在中高温却是激活作用，而且伴随温度升高，激活作用增强。

3.芳香酯酶的结构分析

晶体结构解析与三级结构分析可以指导解析酯酶催化的分子机理以及从结构层面理解酯酶酶学性质的分子机制，芳香酯酶LggAE的同源酶酯酶D与抑制剂磷酸二乙酯复合体的结构分析（图10a）显示其具有一个典型的α/β水解酶催化结构域，属于α/β水解酶超家族，与标准α/β水解酶催化结构域相比，LggAE缺失β1折叠，催化结构域由7 股β-折叠组成，两侧由5 股α-螺旋环绕，其中一段长α-螺旋的部分与另一α-螺旋覆盖于催化结构域上方而构成帽子（Cap）结构域。结构分析（图10b）显示LggAE的催化三联体由残基Ser94-His219-Asp188组成，其中亲核进攻残基Ser94定位于β5后的亲核肘，形成G-L-S-L-G丝氨酸催化基序，LggAE的氧洞由残基Tyr24和Leu95的主链氨基形成，催化三联体与氧洞共同构成了芳香酯酶LggAE的催化活性中心。

如图11所示，酯酶D与产物丁酸复合体的三级结构分析显示芳香酯酶LggAE的底物结合口袋为孔洞状，CASTp分析显示其底物结合口袋的体积仅为240.7 Å3，容积较小，表明LggAE可能适合容纳中链长酰基苯酚酯底物。LggAE的底物结合口袋主要由疏水性脂肪族氨基酸残基组成，如氨基酸残基Ala23、Leu93、Ile120、Leu127、Leu190和Val191，构成一个疏水性孔腔，可以与酯底物的酰基链和醇基链形成范德华力。

结论

对来源于益生菌鼠李糖乳杆菌LGG的新型芳香酯酶LggAE进行基因克隆、异源表达和亲和纯化，并对其酶学性质系统表征和三级结构分析。芳香酯酶LggAE可以催化水解一系列芳香底物对硝基苯酚酯，并展现出一些新颖酶学性质，其偏好水解中酰基链长对硝基苯酚酯，在较宽碱性pH值范围内表现出高催化活性，受乙二醇激活，耐受二甲基亚砜，耐受较高浓度的柠檬酸钠和氯化钠。结构分析表明其底物结合口袋呈较小的孔洞状，主要由脂肪族氨基酸残基构成。LggAE的发现丰富了益生菌/乳酸菌酯酶库。

本文《鼠李糖乳杆菌LGG芳香酯酶的酶学表征与结构分析》来源于《食品科学》2023年44卷第8期162-169页，作者：李新锋，郭彤彤，李彬春。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220426-332。