食品界

李飞副教授等：蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用

蛹虫草（Cordyceps militaris）是一种具有广泛用途的药食两用真菌，含有虫草素、腺苷、多糖等多种活性物质，具有抗氧化、抗癌等功效。蛹虫草的菌丝与子实体在生长发育过程中转化培养基中的糖类、蛋白质等物质，同时产生了化学结构多样、生物功能多种及作用多靶点的代谢产物，如酶类、生物碱类、多肽类等物质，这些代谢产物表现出了食品与医药的巨大潜力。人参皂苷是人参的主要功能活性成分，具有抗癌、促进血液循环、改善血管功能、预防心肌缺血等多种功能。人参皂苷大约占人参干质量的4%，其中Rb1、Rb2、Rc、Rg1等含量较高的人参皂苷被称为固有人参皂苷，而人参皂苷Rd、CK、Rg3等在天然情况下含量极少的人参皂苷被称为稀有人参皂苷。经研究证明稀有人参皂苷相比于固有人参皂苷具有较好的胃肠道吸收率、更高的生物利用度。

本研究筛选与鉴定1株采自长白山原始森林性状稳定的蛹虫草菌株。在此基础上，通过研究在不同条件下菌种产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸和生物量的规律，并利用蛹虫草将固有人参皂苷Rg1和Rc进行转化，以期得到既含有多种稀有人参皂苷又含有蛹虫草活性代谢产物的具有双重药效成分的菌质产物，为更好地研究蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶提供科学依据，并为将蛹虫草和人参食品、药品开发提供一定理论基础。

1 菌株的鉴定与筛选

将10株本实验室保存的采自长白山原始森林野生虫草属真菌菌株进行鉴定与筛选，测序结果与NCBI数据库中的数据进行对比，确定菌株XZ和HJ属于粉棒束孢（Isaria farinosa），YP、ZZ和QT属于玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea），CH属于子囊菌（Ascomycota sp.），C01、C02和C03属于蛹虫草（Cordyceps militaris），SM属于枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）。将10株菌株扩大培养得到的种子液接种至初始pH 7的扩大培养基中，分别培养至72、96、120 h后，测定上清液中β-葡萄糖苷酶活力，如图1所示，酶活力最高大多数在培养时间为96 h，3株蛹虫草中C03最高酶活力出现在96 h，达到（31.8±0.96）U/mL。

蛹虫草C03的ITS系统发育分析结果如图2所示，根据同源性对比结果，将菌株鉴定得到的序列通过软件MEGA 7.0构建系统发育树。结果显示菌株C03与C. militaris属于同属。本实验以蛹虫草C03为研究对象，对碳源、氮源及pH值对其产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸与生物量的影响进行研究。

2 碳源对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性及虫草酸和生物量的影响

2.1 碳源对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响

微生物初级代谢产物和次级代谢产物的生物合成与培养基组成和培养条件密切相关。在不同碳源、培养基初始pH 7、25 ℃、100 r/min条件下，分别培养72、96、120、144、168 h和192 h后，测定上清液中的β-葡萄糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力，结果如图3所示。

碳源为纤维二糖时，96h和120h时β-葡萄糖苷酶活力达到最高，分别为（25.36±0.46）U/mL和（20.78±0.11）U/mL。乳糖在120h β-葡萄糖苷酶活力达到（19.34±0.89）U/mL，微晶纤维素和羧甲基纤维素在144 h分别达到（18.96±0.15）U/mL和（21.15±0.15）U/mL。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力在碳源为乳糖的48～96 h期间内都保持较高的活力，72 h达到最高的（7.12±0.08）U/mL。依次是淀粉、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，这6种碳源都在72 h达到了最高酶活力，可以看出，相对于多糖及双糖，单糖对于蛹虫草C03产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶影响较小。

2.2 碳源对虫草酸和生物量的影响

从图4可以看出，96～144 h区间内虫草酸产量较高，而且碳源为葡萄糖、蔗糖、纤维二糖和淀粉时，蛹虫草C03的虫草酸产量较高，碳源为微晶纤维素与羰甲基纤维素时产量较低。不同碳源对生物量的影响不显著，大多较高的生物量出现在72～96 h的区间内。比较不同碳源对酶活性的影响与其对虫草酸及生物量的影响发现两者之间并没有显著相关性。

利用HPLC方法检测了不同碳源在酶活力较高时（120 h）蛹虫草中虫草素的含量，结果发现碳源为乳糖时样品中的虫草素质量浓度达到（3.56±0.20）mg/L，与葡萄糖（（0.04±0.01）mg/L）、蔗糖（（0.53±0.07）mg/L）、果糖（（0.17±0.04）mg/L）、淀粉（（0.03±0.01）mg/L）相比较高。

3 氮源对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性及虫草酸和生物量的影响

氮源对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响

在选取纤维二糖作为碳源，在不同氮源（玉米浆粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠和硫酸铵），培养基初始pH 7的条件下，分别测定β-葡萄糖苷酶活力、虫草酸含量以及生物量。选取乳糖为碳源，测定不同氮源条件下上清液中的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力。如图5所示，蛹虫草C03的β-葡萄糖苷酶活力整体趋势是有机氮源大于无机氮源。特别是当氮源为蛋白胨，在120 h蛹虫草C03的β-葡萄糖苷酶活力达到（58.76±1.18）U/mL，当氮源为牛肉膏时，在144 h和168 h酶活力达到（46.97±0.33）U/mL和（61.58±0.09）U/mL。同样的规律也适用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，蛹虫草C03在有机氮源下的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力大于无机氮源。氮源为蛋白胨，培养时间为72 h时，蛹虫草C03产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力最高为（11.68±0.04）U/mL。

3.2 氮源对虫草酸和生物量的影响

如图6所示，虫草酸产量在氮源为玉米浆粉及蛋白胨的条件下总体上高于其他氮源，而对于生物量来讲却是无机氮源硝酸钠与硫酸铵的生物量稍高，当氮源为蛋白胨，培养时间为96 h，虫草酸的最大值达到（21.09±0.96）mg/L。生物量最大值出现在硝酸铵为氮源，培养时间96 h，达到（0.46±0.05）g。

同时在不同氮源的情况下，对培养120 h样品中的虫草素含量进行了测定，结果发现当氮源为牛肉膏时虫草素质量浓度为（10.40±0.45）mg/L，显著高于玉米浆粉（（0.29±0.05）mg/L）、蛋白胨（（3.56±0.20）mg/L）、硝酸钠（（ 1.42 ± 0.03 ） m g / L ）和硫酸铵（（0.33±0.01）mg/L）。

4 pH值对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性及虫草酸和生物量的影响

pH值对β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响

对于菌株C03，当以纤维二糖为碳源，牛肉膏为氮源，在不同培养基初始pH值（3、4、5、6、7、8、9、10）的条件下，培养120 h后，测定β-葡萄糖苷酶活力、虫草酸含量与生物量。从图7A可知，β-葡萄糖苷酶活力在pH 8条件下有最优值，为（74.70±0.09）U/mL。

pH值对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响结果如图7B所示。当pH值在3～4之间时，酶活力随pH值增加呈上升的趋势。在pH 4条件下，酶活力达到最大（11.55±0.01）U/mL。当pH值超过4时，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有下降的趋势，在pH值大于6时，各时间段的酶活力急速下降，当pH值达到弱碱性8时，在培养时间为24、48、96、120 h，测得其酶活力皆很低。由此可以得出，蛹虫草C03产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶较适合在酸性条件下培养，其最佳pH值为4。

pH值对虫草酸和生物量的影响

从图8可以看出，pH值为8时，蛹虫草C03的虫草酸产量最高，达到（48.99±0.59）mg/L。pH值为中性附近，生物量的值较高，最大值为pH 8时，达到0.67 g。同样，在测定不同pH值条件下样品中虫草素含量时发现，当pH 5时的环境最有利于虫草素的产生和积累，虫草素质量浓度达到（19.42±0.45）mg/L，高于pH 4（（3.87±0.01 mg/L））、pH 6（（8.25±0.35 mg/L））、pH7（（4.78±0.60mg/L））和pH8（（2.98±0.35mg/L））。

5 蛹虫草C03转化人参皂苷Rg1与Rc分析

转化路径

蛹虫草C03在转化培养基中转化人参皂苷Rg1，分别在72、96、120 h时，UPLC-Q-TOF-MS法测定转化产物中的人参皂苷组成，结果见表1。在3个样品中均鉴定出人参皂苷Rg1、F1和Rh1。分析人参皂苷Rg1的结构，它含有2个葡萄糖苷键，图9显示了Rg1在β-葡萄糖苷酶作用下水解，一是C20上的C20-O-β-(1→6)-葡萄糖苷键：Rg1→Rh1；二是C6位上的C6-O-β-(1→6)-葡萄糖苷键：Rg1→F1。UPLC-Q-TOF-MS鉴定产物得到的结果通过HPLC分析也得到了证实。

利用UPLC-Q-TOF-MS检测蛹虫草C03转化人参皂苷Rc的产物中的人参皂苷组成，结果如表2所示。72 h与96 h的转化产物中含有人参皂苷Rd、Rc、CMc与CK，120 h的转化产物中有人参皂苷Rd、Rg3、CMc与CK。

通过分析人参皂苷Rc的结构与转化产物的人参皂苷组成，推断蛹虫草C03转化人参皂苷Rc的转化路径如图10所示。人参皂苷Rc结构C20位中含有1个阿拉伯呋喃糖苷键和1个葡萄糖苷键，C3位上含有2个葡萄糖苷键，72、96 h和120 h的转化产物中含有人参皂苷Rd，可以推断Rc首先在蛹虫草C03所产α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的作用下水解，生成C20位上有1个葡萄糖苷键、C3位上含有2个葡萄糖苷键的人参皂苷Rd。在这之后C20位上剩余的1个葡萄糖苷键被水解后就会生成人参皂苷Rg3，而120 h转化产物中含有的Rg3就证明了这一路径的存在。β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶共同作用，水解C20位上的阿拉伯呋喃糖苷键和葡萄糖苷键获得了人参皂苷Rd和Rg3。

分析人参皂苷Rc与CK的结构发现，β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rc中C3位上的2个葡萄糖苷键以及α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶水解C20位上的阿拉伯呋喃糖苷键可以获得人参皂苷CK，同时水解C20位上的阿拉伯呋喃糖苷键和C3位上的2个葡萄糖苷键可以获得人参皂苷CK。而人参皂苷CMc的获得是C3位上的2个葡萄糖苷基团被β-葡萄糖苷酶水解获得。因此，蛹虫草C03转化Rc路径为Rc→Rd→Rg3→CK和Rc→CMc。

转化率

利用HPLC分别测定了人参皂苷Rg1转化产物中Rh1和F1及Rc转化产物中人参皂苷Rd和CK含量。如图11A所示，人参皂苷Rg1在96～120 h内含量下降较快，96 h和120 h时转化率分别为18%和41.7%，168 h人参皂苷Rg1的转化率达到54.9%，人参皂苷Rh1与F1产量分别达到了（27.83±1.72）μg/mL与（16.19±1.12）μg/mL。如图11B所示，人参皂苷Rc同样在96～120 h内含量下降较快，96 h和120 h转化率分别达到30.74%和71.75%，168 h人参皂苷Rc转化率达到83.44%，人参皂苷Rd和CK产量分别为（9.01±0.1）μg/mL与（3.51±0.03）μg/mL。结果表明人参皂苷Rg1与Rc都是在96～120 h的区间内含量下降较快，这与β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在此区间内有较高酶活力的结果一致。

6 结论

从长白山原始森林中采集的10株虫草属真菌中筛选得到了1株产β-葡萄糖苷酶活力较强的菌株，通过序列同源性分析和系统发育树可以鉴定其属于蛹虫草。在对不同碳源、氮源和pH值对蛹虫草C03产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸和生物量的规律研究基础上，将菌株应用于转化人参皂苷Rg1和Rc方面，得到转化路径及转化率。本研究得到了既含有多种稀有人参皂苷又含有蛹虫草活性代谢产物具有双重药效成分的菌质产物，为更好地研究蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶提供了科学依据，同时也为蛹虫草和人参食品、药品开发提供了理论基础。

本文《蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用》来源于《食品科学》2023年44卷8期152-161页，作者：李飞,黄秋婷,隋新等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220427-349。