食品界

Abstract

牡蛎由于其营养和生物活性成分而具有广泛的功能。然而，牡蛎蛋白的生物活性肽的抗糖尿病和抗氧化很少见报道。本文使用磷酸盐缓冲盐水从新鲜牡蛎中提取牡蛎蛋白，并进行模拟胃肠消化。在体外模拟胃肠消化过程中研究了水解程度、结构表征、分子量分布、游离氨基酸、抗糖尿病活性和抗氧化活性。结果表明，牡蛎蛋白胃肠消化物的α-葡萄糖苷酶抑制活性、α-淀粉酶抑制活性、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性分别从0%提高到33.96%、从9.17%提高到44.22%、从9.01 µg trolox/mg 蛋白质提高到18.48 µg trolox/mg 蛋白质（P<0.05），以及从21.44 µg trolox/mg蛋白质到56.21 µg troox/mg 蛋白质。此外，在模拟胃肠消化过程中，水解度、β-转角结构、荧光强度、游离氨基酸和短肽含量（MW < 1 000 Da）增加。这些结果表明，从牡蛎蛋白中获得的牡蛎蛋白水解物可用作天然的抗糖尿病和抗氧化剂。

Introduction

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。长期的高血糖水平会产生一系列问题，如微血管并发症、勃起功能障碍、视网膜病变、白内障、肾病和神经病变，等等。目前，糖尿病的发病率在全球范围内大量增加，导致了巨大的经济和社会困难。2019年，有4.63亿DM患者--超过全球成年人口的9.3%。到2045年，糖尿病患者将达到7亿人，增加51%。此外，2型糖尿病约占所有DM病例的90%，其中75%的患者居住在发展中国家。因此，糖尿病是一个主要的全球公共卫生问题。改善糖尿病的一种方法是改善胰岛抵抗和氧化应激，而另一种方法涉及抑制重要酶的活性，如α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和二肽肽酶-IV。酶抑制剂是口服抗高血糖药，可降低T2DM的血糖水平，可能与糖尿病相关酶活性位点的关键氨基酸相互作用，产生抑制作用。目前，常用的酶抑制剂药物包括阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等。然而，长期使用这些药物可能会导致胀气、呕吐、腹泻等不良反应。因此，一些研究人员已经发现并使用了天然和安全的抗糖尿病药物。

生物活性肽通常是来自不同来源的蛋白质片段，它们发挥着广泛的益处，被认为是营养和健康的产品；因此，它们在营养保健品方面得到了应用。食物来源的生物活性肽和含有2~20 个氨基酸的水解物通常是通过使用从微生物、动物或植物中获得的蛋白酶进行选择性的酶解而产生的。食品蛋白/肽被认为比合成药物更安全、更容易被吸收。因此，人们越来越重视发现具有生物活性的新型食物肽，如抗糖尿病、抗菌、抗氧化、抗高血压、抗血栓、免疫调节和成骨活性。然而，关于如何从牡蛎蛋白水解物中生产抗糖尿病和抗氧化肽的报道很少。

因此本研究的目的是探讨牡蛎蛋白体外模拟胃肠消化引起的水解度（DH）、结构特征、分子量（MW）分布、游离氨基酸、抗糖尿病和抗氧化活性的变化。首先，作者研究了蛋白质水解物的电泳蛋白模式、DH和结构特征的测定。其次，评估了MW分布和游离氨基酸浓度。最后，讨论了模拟胃肠道消化的牡蛎蛋白水解物在每个阶段的抗糖尿病和抗氧化活性。

Results

牡蛎蛋白模拟消化的电泳图谱如图1A所示，其中牡蛎蛋白胃蛋白酶消化前后蛋白条带差异最为显着。在牡蛎蛋白中观察到一些蛋白质条带，分子量介于 15 和 250 kDa 之间。在胃蛋白酶消化过程中，15～100 kDa的条带消失，观察到新条带产生（约 10 kDa）。胰酶消化1 h（PP1）到4 h（PP4），100~150 kDa和10 kDa左右的条带消失；这些结果意味着蛋白质或肽在胰酶水解后可以形成大多数低分子量或游离氨基酸的肽。牡蛎蛋白水解程度如图 1B 所示。在模拟胃肠消化过程中，OP 的 DH 显着增加（P < 0.05），并在 PP4 表现出最高的水解度。OP的水解度在P1迅速增加，PP1分别增加到11.73%和26.79%，然后由于胃蛋白酶和胰酶消化系统中蛋白质底物和酶切位点减少而缓慢增加并趋于稳定。然而，没有观察到P1和P2之间的显着差异，这表明OP对胃蛋白酶的消化具有抗性。肠道模拟消化中水解度的增加高于胃模拟消化。这可能是由于胃蛋白酶的主要切割位点是与疏水相邻的芳香族氨基酸的肽键。同时，胰酶的主要切割位点主要是氨基酸羧基上的肽链，切割位点越多，蛋白质的分解越彻底。

图1 牡蛎蛋白水解物的SDS-PAGE电泳（A）和水解度（B）

蛋白质红外光谱的酰胺I带（1 600^-1~1 700 cm^-1）主要是C=O键的伸缩振动，反映了蛋白质的二级结构。牡蛎蛋白及其水解产物的 FTIR 光谱如图 2A 所示。图 2B 通过对酰胺 I 带 β-折叠 (1 600~1 640 cm^-1)、无规卷曲 (1 640~1 650 cm^-1)、α-螺旋 (1 650~1 660 cm^-1) 或 β-转角 (1 660~1 700 cm^-1)。与牡蛎蛋白相比，其水解产物的二级结构发生显着变化，随着消化时间的增加，α-螺旋减少，β-转角增加。α-螺旋结构是一种有组织的结构，易于在蛋白质二级结构之间发生构象变化。β-折叠和β-转角结构是相对拉伸的有序结构，而随机结构是无序的。在模拟消化过程中，牡蛎蛋白的α-螺旋转化为β-转角。这种现象表明牡蛎蛋白的构象部分展开，有序结构被破坏，使分子结构变得灵活和自由。图2C和2D分别显示了牡蛎蛋白及其水解产物在320~400 nm范围内的固有荧光强度和最大吸收波长（λmax）。从酪氨酸 (Tyr) 到色氨酸 (Trp) 的能量转移以及附近基团的荧光爆发对固有荧光强度有显着影响。在这项研究中，这些水解产物的荧光强度高于牡蛎蛋白，这表明在模拟消化过程中，从 Tyr 到 Trp 的能量转移增加，或荧光爆发基团的数量减少。在 280 nm 激发后，牡蛎蛋白的 λmax 为 345 nm。与牡蛎蛋白相比，所有水解产物的固有荧光强度红移 11~13 nm。λmax 红移反映了牡蛎蛋白构象的变化，这增加了水相中色氨酸残基的水平。

图2 牡蛎蛋白在不同消化时间的结构特征变化。A：傅里叶变换红外光谱。B：牡蛎蛋白及其水解产物的二级结构。C：荧光光谱。D：色氨酸的最大荧光发射波长。

如图 3A 所示，通过 HPLC 评估了在胃肠道消化的每个阶段的酶水解产物的体外模拟的分子量分布和组成。不同消化时间的 6 个水解物的 HPLC 曲线具有差异。在 15.35 min 之前长时间洗脱的峰代表分子量大于3 000 Da，15.35 min 到 17.56 min 代表分子量为 1 000~3 000 Da，大于 17.56 min 代表分子量小于1 000 Da。在图 3B 中，随着牡蛎蛋白模拟胃消化时间的推移，3 000 Da 以上的蛋白质和肽的分子量逐渐降低，在 PP3 和 PP4 达到稳态。模拟肠道消化后，肽的比例（MW < 1 000 Da）从 41% 增加到 91% 以上。

图3 体外模拟胃肠道消化过程中各阶段的水解物的分子量分布（A）和组成（B）

不同时间模拟胃肠消化中游离氨基酸含量见表1。蛋白质水解产物中的游离氨基酸和短链生物活性肽在人体对营养物质的生理吸收中起主要作用。胃蛋白酶模拟胃消化2 h后，总氨基酸（TAA）含量较空白（OP）显着增加118.5%。然而，用胰酶模拟肠道消化4 h后，TAA含量显着增加1190.5%。结果表明，在胃模拟消化过程中，OP主要被分解为小肽。在用胰酶模拟肠道消化后，这些肽进一步水解成游离氨基酸。其他蛋白质也有类似的报道。模拟肠道消化后，非必需氨基酸（NEAA）、必需氨基酸（EAA）、苦味氨基酸、鲜味氨基酸、甜味氨基酸由2.62增加到29.63；从 3.51 到 143.43；从 1.09 到 88.96；从 1.78 到 4.19；和从 1.22 到 20.77 mg/g。

表1 牡蛎蛋白体外模拟胃肠消化过程中游离氨基酸（mg/g）含量的影响

如图 4A 所示酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制活性在模拟胃消化中没有抑制活性，但随着肠模拟消化时间的增加显着增加，同时均低于阿卡波糖。模拟肠道消化后最高抑制率为(33.95±2.15)%；在本研究中，抑制性 α-葡萄糖苷酶活性的增加可归因于氨基酸（Thr、Lys 和 Tyr）含量的增加。抑制α-淀粉酶活性被认为是控制2型糖尿病的有效方法。如图 4B 所示，通过在每个阶段模拟胃肠消化从牡蛎蛋白获得酶解物的α-淀粉酶活性的抑制。随着肠道模拟消化时间的增加，酶解物α-淀粉酶活性的抑制显着增加，在 PP4 时最大值为(44.22 ± 0.65)%。α-淀粉酶活性抑制的增加可能归因于氨基酸含量的增加（例如，Thr、Arg、Phe 和 Tyr），因为生物活性肽与α-淀粉酶活性位点相互作用或结合抑制α-淀粉酶的活性。肽中的氨基酸（如 Arg、Lys、Asp、Glu、Pro、Leu、Gly、Phe、Ser、Try 和 Tyr）可能与 α-淀粉酶激活结构域相互作用。据报道，小于3 000 Da 的肽对α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性具有更好的抑制活性。

A：α-葡萄糖苷酶抑制率；B：α-淀粉酶抑制率。
图4 牡蛎蛋白和酶解物的抗糖尿病活性
牡蛎蛋白和酶解物在每个阶段的 DPPH 自由基清除活性如图 5A 所示。牡蛎蛋白的 DPPH 自由基清除活性在开始时为 (9.01 ± 0.87) µg trolox/mg 蛋白质。胃模拟消化后，DPPH 自由基清除显着增加到 (23.79 ± 2.14) µg trolox/mg 蛋白质。然而，在模拟肠道消化后，DPPH 自由基清除显着降低至 (18.48 ± 2.41) µg trolox/mg 蛋白质。在模拟胃消化过程中，疏水性和芳香性氨基酸之间的肽键被破坏，大量的疏水性氨基残基侧链基团暴露出来，使蛋白质、肽和游离氨基酸更容易正确反应。DPPH 自由基，也使它们更容易被自由基捕获。胰酶的进一步消化，选择性地切割氨基酸导致氨基酸和短肽的积累，而酶水解产物的极性增加使其难以与 DPPH 自由基相互作用。如图 5B 所示，与牡蛎蛋白（21.44 ± 1.28）µg相比，被胃蛋白酶和胰酶消化的牡蛎蛋白显着增加了 ABTS 自由基清除（分别为 (43.59 ± 1.44) 和 (56.21 ± 1.20) µg trolox/mg 蛋白质）。ABTS 自由基清除活性随着模拟消化时间的增加而增加。在模拟胃消化阶段，胃蛋白酶消化引起的结构变化可能有助于捕获 ABTS 自由基清除。随着它继续被胰酶水解，肽键断裂，导致肽和游离氨基酸更短，它们变得更加亲水并增加极性，很容易与水溶性 ABTS 自由基反应。

图5 牡蛎蛋白和酶解产物的抗氧化活性。A：DPPH自由基清除活性；B：ABTS自由基清除活性。
Conclusion
该研究表明，只有胃模拟消化提高了 DPPH 自由基清除活性，而用胰酶进一步消化将 ABTS 自由基清除活性提高了 (56.21 ± 1.20) µg trolox/mg 蛋白质。总体而言，模拟胃肠消化后，水解度、α-葡萄糖苷酶和 α-淀粉酶抑制率分别增加至 (38.87 ± 1.76)%、(33.95 ± 2.15)% 和 (44.22 ± 0.65)%。牡蛎蛋白的α-螺旋结构展开，内源性荧光强度增加。目前的结果表明，牡蛎蛋白可能具有作为功能性食品、膳食补充剂和保健品的抗氧化剂和抗糖尿病前体的潜在应用。虽然本文取得了有益的结果，但未来的实验应继续研究体外模拟胃肠消化获得的酶解物的分离纯化、肽序列的构效关系，以及利用动物实验验证抗糖尿病和抗氧化双重功能活性。
作者简介
第一作者

朱东阳，大连工业大学博士研究生，食品科学与工程专业。研究方向为蛋白质资源开发与利用，多肽的包埋递送。以第一作者发表SCI论文2篇。
通信作者

杜明，教授，博士生导师，大连工业大学朱蓓薇院士团队“蛋白质科学与技术”研究方向负责人。国家万人计划科技创新领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、2011年教育部新世纪优秀人才支持计划、兴辽计划领军人才（辽宁省特聘教授）、辽宁省优秀专家、省农业创新团队首席、辽宁省“百千万人才工程”(百人层次)、大连市杰出青年科技人才等荣誉称号。兼任中国食品科学技术学会青年委员会委员、中国畜产品加工研究会常务理事、中国农学会农产品贮藏加工分会理事、中国营养学会骨营养与健康专业委员会副主任等职务；学术兼职包括eFood共同主编（ISSN: 2666-3066）、Food Science and Human Wellness、Protein and Peptide Letters、《食品科学》、《食品工业科技》等期刊编委。主要从事的研究领域：（1）食源性蛋白构效关系及活性机制；（2）专用功能性蛋白质配料加工技术；（3）民族特色食品加工及产业化。主持国家十三五重点研发专项项目、国家十四五重点研发专项项目、国家自然科学基金重点项目等科研课题30余项。在Biotechnol. Adv.等期刊以第一或通讯身份发表SCI收录论文80余篇, ESI高被引文章2篇（Food Chemistry等），封面论文2篇（Journal of Agricultural and Food Chemistry、Food & Function）；主编或参编Springer等出版著作《Mineral Containing Proteins》、《Biologically Active Peptides》等13部，第一发明人授权国家发明专利11项。

The dual-function of bioactive peptides derived from oyster (Crassostrea gigas) proteins hydrolysates

Dongyang Zhu^a, Zhen Yuan^a, Di Wu^a, Chao Wu^a, Hesham R. El-Seedi^b,c, Ming Du^a,^*
^a School of Food Science and Technology, National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
^b Pharmacognosy Group, Department of Pharmaceutical Biosciences, Uppsala University, Biomedical Centre, Uppsala SE 751 24, Sweden
^cInternational Research Center for Food Nutrition and Safety, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
*Corresponding author.
Abstract
Oysters (Crassostrea gigas) have a wide range of functionality due to their nutritional and bioactive components. However, the bioactive peptides of oyster proteins are rarely reported, particularly their anti-diabetes effects and antioxidants. Oyster proteins were extracted from fresh oysters using phosphate-buffered saline and simulated gastrointestinal digestion was performed. The degree of hydrolysis (DH), structural characterization, molecular weight (Mw) distribution, free amino acid, anti-diabetic activity, and antioxidant activity were studied during in vitro simulated gastrointestinal digestion. The results showed that the α-glucosidase inhibitory activity, α-amylase inhibitory activity, DPPH radical scavenging activity, and ABTS radical scavenging activity of the oyster protein gastrointestinal digest were increased (P < 0.05) from 0 to 33.96 %, from 9.17 % to 44.22 %, from 9.01 µg trolox/mg protein to 18.48 µg trolox/mg protein, and from 21.44 µg trolox/mg protein to 56.21 µg trolox/mg protein, respectively. Additionally, the DH, β-turn structure, fluorescence intensity, free amino acid, and short peptide content (Mw < 1000 Da) increased in the simulated gastrointestinal digestion. These results indicate that the digestive hydrolysates obtained from oyster proteins could be used as natural anti-diabetic and antioxidant agents.
Reference:
ZHU D Y, YUAN Z, WU D, et al. The dual-function of bioactive peptides derived from oyster (Crassostrea gigas) proteins hydrolysates[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1609-1617. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.006.