食品界

中国肉研中心郭文萍高级工程师等：4 种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立

随着人们生活水平的提高，肉类逐渐成为人们餐桌上的主角，而肉类掺假问题也成为国内外重点关注的食品安全问题之一。驴肉制品由于营养价值高、口感佳，在我国华北地区广受欢迎，但由于供应量小，使其价格偏高，这就导致一些蓄意掺假行为的发生。因此，建立快速有效的动物源性成分检测方法，实现对肉种的高通量精准鉴别，对风险监测技术手段的提升和肉制品行业监督管理具有重要的意义。

中国肉类食品综合研究中心的范维、高晓月、郭文萍*等通过研究建立一种高通量、快速、准确的多重TaqMan探针实时PCR（real-time PCR）技术方法，并对该方法在生肉、煮肉、烤肉、风干肉、油炸肉和高温高压灭菌肉中的适用性进行评估，使其可以真正应用于市场上深加工肉制品的真伪鉴别，弥补目前标准中的空缺，为监管部门开展肉制品掺假鉴别风险监测提供有效的技术支撑。

01 引物、TaqMan探针可行性、包容性及特异性验证结果

从图1可知，所设计的4 组引物、探针分别可以在各自对应的目标基因组序列中搜索到，说明4 组引物探针可以用于驴、马、猪、鸭4 种目标源性的real-time PCR检测。此外，通过27 种动物源性多重realtime PCR检测结果发现（表2、图2），本实验开发的方法对常见的驴、马、猪、鸭品种均可检出，且当添加DNA模板质量浓度为20 ng/μL时，非特异性信号Ct值均大于35.0。由此可见，驴、马、猪、鸭四重体系具有较好包容性，且在Ct值≤35.0时，对非目标源性无交叉反应。

02 多重real-time PCR灵敏度实验结果

从图3 可知，4 种源性在D N A 质量浓度范围2×10¹～2×10^－4 ng/μL内具有良好的线性相关性。驴源性标准曲线为y＝－2.9157 x＋19.116，R²＝0.9985，Eff＝110.3%；马源性标准曲线为y＝－3.2937x＋19.584，R²＝0.9935，Eff＝101.2%；猪源性标准曲线为y＝－3.0317x＋19.117，R²＝0.9985，Eff＝103.7%；鸭源性标准曲线为y＝－3.2646x＋18.226，R²＝0.9937，Eff＝102.4%；内参基因标准曲线为y＝－2.9629x＋22.168，R²＝0.9943，Eff＝110.6%。由此可知，本实验开发多重real-time PCR方法可检测到质量浓度为2×10^-4 ng/μL的模板DNA。而当模板DNA质量浓度低于该质量浓度时，仍有扩增，但不呈线性关系，且重复性和准确性差。

03 不同加工工艺产品检测中的适用性及检出限结果

如表3所示，经煮熟、油炸和高温高压灭菌的混合肉样品中目标源性的Ct值相对高于其他加工工艺。此外，通过不同掺入比例样品的测定结果发现，当掺入比例较大时，不同加工方式不会对该方法检出目标源性造成影响；但当掺入比例为0.001%时，高温高压灭菌和油炸两种加工方式下，目标源性检出Ct值存在＞35的情况，且重复性较差。以驴源性数据为例，在10 次重复实验中，驴肉掺入比例为0.001%的生肉样品、煮肉样品、烤肉样品、干制肉样品检出阳性概率为100%（10/10），高温高压肉样品和油炸肉样品检出阳性概率分别为50%（5/10）和70%（7/10）；而驴肉掺入比例为0.01%的5 种熟肉制品样品检出阳性的概率均可达到100%（10/10）。其余3 种源性以同样的方式计算检出限。综上，为确保使用本方法进行肉及肉制品检测准确性，现规定本方法对于生肉的检出限为0.001%，对于熟肉制品的检出限为0.01%。该检出限低于SN/T 3730.4—2013、SN/T 3730.5—2013、GB/T 38164—2019标准中规定的1%。

04 实际样品检测结果

采用本实验建立的多重real-time PCR方法与标准方法同时对100 份实际样品进行检测，结果见表4。本方法与国标方法均有17 个驴肉样品检出含有其他3 种源性成分，不合格率为17%（17/100）。两种方法的检测结果均为：8 个样品只检出马源，3 个样品只检出猪源，3 个样品只检出鸭源，2 个样品检出马源和驴源，1 个样品检出猪源和驴源；30 个生肉样品的不合格率为3.3%（1/30），30 个深加工熟肉制品的不合格率为16.7%（5/30），40 个驴肉火烧及肉馅样品的不合格率为27.5%（11/40）。总体上，两种方法的检测结果一致，说明所建方法结果可靠，可以用于驴肉及其制品中常见掺假源性成分的检测。

05 结论

建立了驴、马、猪、鸭四重TaqMan探针型real-time PCR方法，实现在同一反应管中同时扩增4 种目标源性，达到了缩短检测时间，提高检测效率的目的。本方法采用多拷贝线粒体基因为靶基因，克服了单拷贝基因随着样品热处理温度上升，掺假比例越低，检测结果偏差越大的问题，并充分考虑了不同加工工艺对方法的影响，使得该方法的应用范围从生鲜肉进一步扩展到了深加工熟肉制品。此外，本方法具有较强的特异性和较高的灵敏度，对16 种非目标源性均无交叉反应，且可检测到质量浓度为2×10^-4 ng/μL的模板DNA。通过对5 种不同加工条件（煮、烤、炸、干制、高温高压灭菌）下处理的不同比例混合肉样品进行检测，得到本方法对于生肉的检出限可达到肉含量的0.001%，对于熟肉制品的检出限为0.01%，满足目前各标准中对4 种目标源性检出限的要求。对100 份实际驴肉样品进行检测均与标准方法的检测结果一致，说明本方法具有较高准确性。综上，本研究建立的四重TaqMan探针型real-time PCR方法可以作为一种有效地检测手段，应用于市场上生肉及深加工熟肉制品的真伪性鉴别，为打击非法肉制品掺假欺诈、规范市场秩序和保障人民食品安全提供技术支持。

本文《4 种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用》来源于《食品科学》2023年44卷08期317-323页。作者：范维，高晓月，李贺楠，董雨馨，刘虹宇，李宇轩，郭文萍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220406-056.