食品界

J. Future Foods | 不同桉树品种和地区的月见草素B及其含量的抗增殖活性和细胞抗氧化

Introduction

桉树生长速度快，轮伐期短，是全球木材和纸张生产的主要木材来源。但是，除了用作精油提取的来源之外，桉叶的副产品仍然是巨大的废物。桉树叶传统上被用作治疗炎症、感冒、流感和腹泻的药用植物。在南美和非洲，桉树叶茶可以用来治疗糖尿病。目前，它将焦点转向天然多酚，天然多酚越来越多地被认为是主要由活性氧（ROS）引起的衰老和退行性疾病发病机制的预防和治疗手段。同样，由于生物活性酚类化合物的丰富来源和广阔的市场前景，桉树提取物也受到关注。桉树叶提取物在日本已被批准作为食品添加剂，目前也用于化妆品配方。桉树的叶子含有许多可水解的单宁，具有显著的抗氧化活性。作者发现从桉树叶中分离的可水解单宁在HepG2细胞中表现出更高的细胞抗氧化活性，显示出成为天然抗氧化剂的潜力。因此，本研究的目的是继续从桉树叶中回收具有食品或药物用途的生物活性化合物，其结果可能具有商业意义。

在中国南方，由于桉树具有巨大的经济价值，许多特有的杂交种分布在不同的地区。然而，关于不同种类桉树的生物活性成分的文献资料很少。因此，本研究首先从桉树叶中分离和鉴定了另一种可水解单宁（OEB）。进一步研究了OEB的抗增殖活性和细胞抗氧化活性。最后，分析了遗传和区域对桉树叶中OEB和四种其他生物活性水解单宁含量的影响。这项研究为从桉叶中获得具有抗氧化价值的化合物，以及筛选具有高生物活性成分的桉树品种提供了有用的信息。这将进一步促进桉树经济价值的提高。

Results and discussion

从E. grandis×E. urophylla GL9分离得到的月见草素B（OEB）的鉴定和清除自由基的能力

作者在先前的工作中开发了桉树叶中具有高抗氧化活性的一些药理学活性水解单宁，尤其是pentagalloyl glucose(PGG)，能够显著延长了秀丽隐杆线虫的寿命。在级分II经过Toyopearl HW-40柱后收集了六个子级分，并且子级分PH70（7:3:0）显示出高DPPH自由基清除能力。在本研究中，用制备型HPLC纯化子级分PH70（7:3:0）后获得OEB。如图S3所示，清除率随着OEB浓度的增加而增加。OEB表现出比阳性样品trolox更高的自由基清除活性并且比从桉树叶中分离的可水解单宁更高，包括PGG、Tellimagrandin Ⅰ (T1)和Pedunculagin以及Gemin D。

图1 六个子组分的DPPH自由基清除能力

从E. grandis×E. urophylla GL9分离得到的月见草素B（OEB）的抗增殖活性和细胞抗氧化活性

与化学抗氧化方法相比，基于细胞的分析考虑了细胞摄取、分布和代谢的问题，并提供了更好的抗氧化活性生物学预测。因此，作者想了解OEB是否在HepG2细胞中发挥抗氧化活性。首先，研究了一系列浓度期间的细胞活性，当浓度低于10 μmol/L（干质量）时，OEB被认为对HepG2无细胞毒性。同时，OEB以剂量（6-30 μmol/L）依赖的方式对HepG2细胞发挥抗增殖活性，这可能是完全抑制生长或诱导凋亡的结果。然后，作者发现OEB可以在HepG2中显示抗氧化活性。CAA 8值随OEB浓度的增加而增加。OEB的EC50值测定为0.838 μmol/L，远低于桉树叶片中可水解单宁的EC50，包括PGG（2.18 μmol/L）、T1（6.61 μmol/L），Pedunculagin（13.45 μmol/L）和Gemin D（15.57 μmol/L）。这些数据意味着，在桉树叶的所有可水解单宁中，OEB表现出最高的细胞抗氧化活性。同时，OEB显示出比常见抗氧化剂（如山柰酚、EGCG，杨梅素、trolox和BHA）更高的细胞抗氧化活性，。因此，桉树叶中的OEB在人体细胞中显示出很高的抗氧化活性，有望成为天然抗氧化剂，并在饲料、化妆品、制药和食品工业中替代合成抗氧化剂。作者之前的研究表明，桉树叶的乙酸乙酯提取物表现出高细胞抗氧化活性，这归因于本研究中确定的具有高抗氧化活性的OEB以及其他可水解单宁（包括Gemin D、Pedunculagin、T1和PGG）。

图2 MTT法检测HepG2的活力

图3 测定OEB的细胞抗氧化活性

物种对OEB和其他特征水解单宁含量的影响

桉树叶提取物中的主要酚类化合物已被鉴定，四种特征性可水解单宁Gemin D、Pedunucagin、T1和PGG显示出较高的细胞抗氧化活性，但这些功能成分的含量尚未在中国南方不同的特有桉树种中报道。因此，在本研究中进行了HPLC分析，以研究特征水解单宁（包括OEB）的含量。特征化合物的化学结构和光谱如图3所示（Gemin D、Pedunucagin和T1的反相HPLC光谱有两个峰，由于其差向异构体，在用KBH4/NaBH4处理后，这两个峰变为保留时间不同的单峰）。如表1所示，不同桉树品种中的单宁含量存在差异。总的来说，OEB的含量高于其他四种化合物，并且单体可水解单宁的含量按OEB＞T1＞Peduncathin＞Gemin D＞PGG的顺序降低。OEB和T1的含量在E.wetarensis中相对丰富（分别为3.77%和1.04%），而在E. ptychocarpa 中极为缺乏（分别为0.54%和0.05%）。然而，所有物种的PGG水平最低（<0.10%），这在秀丽隐杆线虫中发挥了细胞抗氧化活性和抗衰老作用。对来自E. wetarensis、E. pellita,、E.urophylla×E. grandis和E. grandis×E. urophylla中五种可水解单宁的总含量进行了测定（分别为5.35%、4.37%、4.28%和3.77%），高于其他物种，而E. ptychocarpa(0.96%)最低。此前，作者还报道了这些物种的TPC（总酚含量）也高于其他物种，其中，来自E. pellita的TPC最高（87.03 mg/g），依次是E.wetarensis (85.59 mg/g)、E. urophylla×E. grandis (74.81 mg/g) 、E. grandis×E.urophylla GL9 (72.84 mg/g)。作者发现五种可水解单宁的总含量与TPC之间存在显著的相关性（r=0.877，p<0.01）。因此，单宁含量的这种变化可能导致桉树叶片中TPC的变化。

图4 可水解单宁的化学结构和光谱

表1 不同树种桉树叶中单宁含量（%）

特征水解单宁含量与种类的相关性

为了确定和验证可水解单宁含量与桉树物种之间的差异和相关性，对9种桉树物种的5种可水解单宁总含量进行了HCA分析。基于组间欧几里得距离的HCA（图4）表明，通过五种可水解单宁的总含量鉴定出两组（Ⅰ和Ⅱ）物种，其差异性≥20.51。距离较短的物种的可水解单宁含量比距离较长的物种更相似。Ⅰ组由4个种组成，包括 E.grandis×E. urophylla、E. urophylla× E. grandis、E. wetarensis和E. pellita。Ⅰ组中5种可水解单宁的总含量均高于3.6%。第Ⅱ组中五种可水解单宁的总含量低于1.6%。当差异大于5时，第Ⅰ组分为两个子组（Ⅰa和ⅠB），第Ⅱ组分为三个子组（Ⅱa、ⅡB和Ⅱc）。测定了五种可水解单宁的总含量。E. grandis×E. urophylla与E. urophylla×E.grandis结果相似，E.urophylla U6和E. camaldulensis的结果相似。

根据9种物种中可水解单宁总含量的聚类分类与先前报告中ISSR（简单序列间重复）标记法的聚类分类相似。有研究小组通过ISSR标记发现E. grandis×E. urophylla和E. urophylla×E. grandis之间的遗传关系十分接近。还有研究通过TSSR标记将E.grandis×E. urophylla、E. urophylla×E. grandis、E. urophylla×E. tereticornis、E.wetarensis和E. pellita分为同组，这与作者的分类相似。这表明遗传关系越密切，水解单宁的总含量越接近。因此，可水解单宁的总含量可以用来预测来自同一区域的基因之间的关系，这比多态性ISSR标记更方便。但根据作者的研究结果，E. camaldulensis和E. torelliana属于同一亚组Ⅱc，这与它们之间的遗传关系不同。这种情况的结果可能是，除了遗传因素之外，许多环境因素（如营养、水、CO₂、光照温度和环境污染）也会改变次级代谢产物（如单宁）的积累。

图5 基于可水解单宁含量和桉树物种之间的欧几里德距离通过层次聚类分析获得的树状图

栽培区域对OEB和其他特征水解单宁的影响

从以上结果可以看出，E. pellita和E. wetarensis的TPC和五种可水解单宁含量高于E. urophylla×E. grandis和E. grandis×E. urophylla GL9，但后面两个物种是中国南方广泛种植、高度适应性和高产的物种。因此从不同地区采集E. urophylla×E. grandis和E. grandis×E. urophylla GL9以研究生物活性化合物的含量。如表2所示，来自不同地区的提取物中，单个可水解单宁的含量表现出可变性，并且单个可水解单宁的含量按照OEB、T1、Pedunaugin、Gemin D、PGG的顺序降低，这在不同物种中是相同的结果。两种植物中来自广州的Peduncathin含量最高，而在E. grandis×E. urophylla GL9也是相同的结果。作者发现在之前的研究中，不同地区的TPC没有显著差异。然而，五种水解单宁的总含量按广州>南宁>湛江>成都的顺序降低。结果表明广州地区的E.grandis×E. urophylla GL9 和E. urophylla×E. grandis中五种可水解单宁的总含量高于其他地区，其次是南宁的E. grandis×E. urophylla GL9。总的来说来自广州的E. grandis×E. urophylla GL9和E. urophylla×E. grandis可以推荐作为开发可水解单宁的资源。

表2 来自不同地区的桉树叶的单宁含量（%）

Conclusion

这项研究深入介绍了OEB的细胞抗氧化活性，并量化了不同物种和地区的桉树叶的单宁含量。结果表明，OEB表现出比其他可水解单宁更高的细胞抗氧化活性。水解单宁含量总体上按OEB、T1、Pedunaugin、Gemin D、PGG的顺序降低。来自中国广州的E.grandis×E. urophylla GL9和E. urophylla×E. grandis被推荐为开发单独可水解单宁的新天然来源，因为它们含有高含量的可水解单宁酸，并且种植广泛，产量高，适应性强。作者还发现，遗传关系越密切，可水解单宁的总含量越相似。这些发现为获得用于回收桉树叶的化合物以及选择具有高生物活性成分的桉树品种提供了有用的信息，本研究将进一步促进桉树经济价值的提高。

第一作者简介

陈运娇，副教授，硕士生导师，华南农业大学与美国新泽西罗格斯州立大学联合培养博士。2011.09-2014.06在美国新泽西罗格斯州立大学从事研究工作。主要研究方向：沿着“肥胖－炎症－衰老”这一条主线，构建精准、高效的降脂、应激、延缓衰老等秀丽线虫模型，将高效、可靠、经济的模式生物秀丽线虫引入到功能性食品因子等活性物筛选体系，并多个层面探究其主要作用靶点。

主持了6项国家、省级项目，参与10多项国家自然科学基金、国家林业公益性行业科研专项、广东省科技厅对外合作及其它项目。发表论文40多篇，其中以第一作者或通讯作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry （Top一区，封面论文3篇）、Food & Function（Top一区）和Journal of Functional Foods（二区）等期刊上发表20多篇SCI论文。

通信作者简介

曹庸，男，1966年3月出生。博士，教授，博士生导师。广东省功能食品活性物重点实验室主任，广东省食品质量标准委员会专家、广东省食品行业协会专家组专家、广州市食品行业协会副会长；高等学校学科带头人。研究方向：未知活性物质的分离精制、结构鉴定；各种功能成分的定性、定量分析测试方法研究；化学、细胞、组织、动物体各层次模型功能评价，功能成分的作用机理研究；利用生物转化技术提高活性成分产量，已知活性物质的分离、纯化生产技术研究；功能成分的应用技术研究与新型功能食品、大健康产品研制等。近5年主持国家科技部、国家自然科学基金和国家林业局等国家级项目共4项、经费267万元；主持省科技厅、教育厅、财政厅项目7项、经费748万元；近5年发表论文169篇，其中被SCI收录47篇，EI收录34篇，中文核心64篇；近5年申报专利47项：已授权18项（其中1项已授权国际专利PCT），29项审批中；获省部级科技进步奖3项；近5年培养博士研究生13名（毕业生8名、在读5名），硕士研究生20多名，指导本科毕业生50余名，2013年获华南农业大学第三届研究生“我爱我师”我最喜爱的导师评选优秀教师。

The anti-proliferative activity and cellular antioxidant activity of oenothein B and its content in different Eucalyptus species and region

Yunjiao Chen^a,1, Qiao Qin^a,1, Hongzhang Chen^b, Qingrong Huang^c, Mingyue Song^a, Suyao Xiao^a, Longbipei Cao^c, Yong Cao^a,*

^a Guangdong Provincial Key Laboratory of Nutraceuticals and Functional Foods, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

^b Infinitus (China) Company Ltd., Jiangmen 510180, China

^c Department of Food Science, Rutgers University, New Brunswick 08901, USA

*Corresponding author.

Abstract

The leaves of Eucalyptus are abundant in natural resources as a novel potential antioxidant and have broad market prospect. Four of characteristic hydrolysable tannins from Eucalyptus leaves have been demonstrated great application potential as natural antioxidants in our previous research. In this study, the bioactive activities of another hydrolysable tannin isolated and identified as oenothein B (OEB) were evaluated. Content of bioactive compound (hydrolysable tannin) from different Eucalyptus species and regions in southern China were investigated. The results showed that OEB not only exerted anti-proliferative activity against HepG2 cell, but also showed higher cellular antioxidant activity than some common antioxidants. Generally, content of characteristic hydrolysable tannins decreased in the order of OEB > tellimagrandin Ⅰ (T1) > pedunculagin > gemin D > pentagalloyl glucose (PGG). E. grandis × E. urophylla GL9 and E. urophylla × E. grandis could be recommended as new natural sources to exploit hydrolysable tannins because of high content, widely plantation and strong adaptability. This study supplied first insight on introduction of high cellular antioxidant activity of OEB and selecting the species and region to exploit natural antioxidants. It will promote the increasing of economic value of Eucalyptus.

Reference:

CHEN Y J, QIN Q, CHEN H Z, et al. The anti-proliferative activity and cellular antioxidant activity of oenothein B and its content in different Eucalyptus species and region[J]. Journal of Future Foods, 2023, 3(4): 392-398. DOI:10.1016/j.jfutfo.2023.03.010.