QuEChERS-超高压液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中的6 种丁香酚类麻醉剂
2023-06-29作者：来源：责任编辑：食品界
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麻醉剂应用于水产养殖中可以提高存活率，我国使用最多的渔用麻醉剂是丁香水门汀（丁香酚含量占99%），因此近年来水产品中频繁检出丁香酚类麻醉剂残留量。丁香酚在日本、澳大利亚、智利和新西兰等国可以在渔业养殖中合法使用，日本和新西兰设定休药期和最大残留限量为0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。我国没有相关的法律法规，对麻醉剂的研究和管理需求也显得尤为重要。因此，建立一种快速、准确的丁香酚类麻醉剂的检测方法才能更好服务于水产品食品安全法规的制定。
中国药科大学基础医学与临床药学学院的林晨、厦门海关技术中心吴敏*和集美大学水产学院王凯等人通过研究建立乙腈提取、QuEChERS净化及超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定多种水产品中6 种丁香酚类药物残留量的方法；通过对比文献对提取净化、色谱、质谱条件进行优化，使用同位素内标法定量，旨在建立准确、快速、有效排除干扰、重现性好、回收率稳定、灵敏度高的方法。
丁香酚类麻醉剂采用的提取剂有丙酮、甲醇、乙酸乙酯、正己烷和乙腈等。先前报道表明乙腈的提取效果比较理想，杂质干扰较小，提取效率高；而且乙腈是QuEChERS法的常用提取剂，乙腈提取后的净化过程中QuEChERS吸附剂可以更充分地吸附样品中杂质。 本研究选取了PSA、C18、MgSO4和吸脂Silica吸附剂进行优化；通过空白样品添加回收，对比了A（50 mg PSA、100 mg C18、50 mg Silica、100 MgSO4）和B（50 mg PSA、100 mg C18、150 mg MgSO4）2 种不同填料的QuEChERS净化效果。使用A组填料的6 种目标物回收率最低，仅为52.4%，表明用于吸脂的未键合活性硅胶正相吸附剂填料对含有酚羟基团的目标物造成吸附而回收率偏低。因此，选择净化填料选择50 mg PSA、100 mg C18、150 mg MgSO4，经过QuEChERS净化后，从明虾样品净化前后的总离子流色谱图看出，杂质峰消失或者减小，净化效果好（图1、2）。
本研究首先采用0.5 µg/mL的丁香酚类药物单标标准液进行流动注射分析，分别在正负离子模式下进行母离子全扫描，确定各种化合物的分子离子；然后对各母离子进行子离子全扫描，选取丰度较强，干扰较小的两对子离子为定性和定量离子，在多反应监测模式下优化去簇电压、碰撞能量、入口电压、出口电压等质谱参数，如表2所示。
本研究对比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.01%甲酸的流动相体系，结果表明：流动相中加入甲酸、丁香酚和异丁香酚则完全被抑制，采用甲醇-水作为流动相时，6 种化合物的峰形及响应最优。选取Agilent zorbax Eclipse Plus-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2 μm）和Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）等不同特点填料的色谱柱进行实验，结果表明：Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）的灵敏度高，峰形良好，能有效排除干扰，对丁香酚类药物的同分异构体能够完全分离，其特定离子色谱图如图3～5所示。
采用空白样品提取后添加法，对比罗非鱼、黄骨鱼、鲈鱼、草鱼、鳙鱼、明虾、罗氏虾等质量浓度为10 ng/mL时的基质效应。其中，罗氏虾和黄骨鱼的干扰较大，基质效应值为0.64～0.97。6 种目标物中丁香酚基质效应值最大，乙酰基异丁香酚基质效应值最小。对比同位素内标法和空白基质匹配标准溶液外标法，发现同位素内标法能够较好排除大部分基质效应，但乙酰基异丁香酚回收率略低；而基质匹配标准溶液外标法回收率为85.6%～129.5%。因此，采用同位素内标法消除基质效应效果好且操作简捷。 将6 种目标物混合标准液和氘代丁香酚内标分别用乙腈稀释成系列标准液，丁香酚和异丁香酚的质量浓度分别为2、3、5、10、20、50、100 ng/mL，其他4 种丁香酚类药物质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL，每种标准使用液中均含有10 ng/mL氘代丁香酚。在实验条件下经UPLC-MS/MS进样检测，以目标物和同位素D3校正后峰面积为纵坐标，与其对应的标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，得到线性回归方程和相关系数。 采用标准内标法进行定量测定，分别向空白鱼、虾中添加6 种丁香酚类药物混合标准溶液和氘代丁香酚内标，以定量离子信噪比大于3的浓度为检出限，丁香酚类药物检出限为0.5～1.5 µg/kg，以定量离子信噪比大于10的浓度为定量限，定量限为2.0～5.0 µg/kg，如表3所示。
对黄骨鱼和罗氏虾基体做空白添加回收实验，添加水平为5、10、40 µg/kg，做6 份平行实验，如表4所示，加标回收率为67.0%～106.4%，相对标准偏差为1.2%～15.7%，满足定量测定的要求。 丁香酚类麻醉剂残留量测定研究较多为气相色谱-质谱法，但此方法中丁香酚会在96 h后降解。采用液相色谱-串联质谱法的研究中：现有研究发现测定水产品中4 种丁香酚类麻醉剂、鱼肉和养殖水中丁香酚、罗非鱼血浆和肌肉中的丁香酚，定量限为2.0 µg/mg和2.5 µg/mg，前处理采用氮吹浓缩，目标物易气化损失。经过对比发现，二甲亚砜辅助浓缩回收率较直接氮吹有明显提高，但是部分样品不够理想，原因是不同水产品中水分和油脂含量差异大，同时检测部分样品易挥发至全干，对实验操作要求高。此外，尚鲜见采用QuEChERS和液相色谱-串联质谱法联用测定水产品中丁香酚类麻醉剂的研究。 市购水产品（共计70 批次淡水鱼和淡水虾）中，有19 批检出丁香酚类麻醉剂，阳性占比为27.1%；其中，19 批中均含有丁香酚，含量为0.005～4.8 mg/kg，有1 批同时检出甲基丁香酚，其检测值大于检出限小于定量限。9 结论
通过对水产品样品前处理条件和仪器检测条件进行优化，建立了QuEChERS-超高压液相色谱-串联质谱法对水产品中6 种丁香酚类麻醉剂的同时定性、定量检测。该方法充分满足国际相关限量（最低50 µg/mg）要求，且具有操作更加简单、灵敏度高、重现性好等特点。
本文《QuEChERS-超高压液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中的6 种丁香酚类麻醉剂》来源于《食品科学》2023年44卷08期324-329页. 作者：林晨，吴敏，王凯，曾三妹，吴佳雯，钟莉萍，凌淞江. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220818-218
