食品界

程平言高级工程师等：呈苦味三羟基十八烯酸UPLC-HRMS测定方法优化及其在白酒检测中的应用

我国白酒因独特固态蒸馏工艺使其不仅赋予白酒复杂的挥发性组分，同时亦能使酒醅中分子质量较大的难挥发组分被迁移入基酒酒体。白酒作为一种嗜好性酒精饮品，其味觉及口感决定了风味质量与消费者偏好程度。一般情况下大多数呈味物质具有难挥发性，但在白酒难挥发组分中，涉及其呈味物质定性定量分析报道较少；其中，白酒中适量的苦味物质能丰富其口感，但大多数白酒会因苦味强度高被认为异味（或杂味）物质。

贵州习酒股份有限公司的杨军林、田栋伟、程平言*等通过全扫描/数据依赖性二级扫描模式（Full MS/ddMS2）获得待测物的分子离子精确质量数，用于其定性定量分析，并结合待测物特征碎片离子的相关信息可有效确证假阳性样品，提高了分析效率，保证了检测结果的准确性，适用于大批量白酒中呈苦味三羟基十八烯酸的快速测定；并用该方法研究酱香型白酒不同发酵轮次和不同贮存时间下呈苦味三羟基十八烯酸含量的变化规律，以及不同典型体基酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量的差异。

1 QE Foucs质谱参数优化

利用Full MS模式对待测化合物和内标化合物进行分子离子扫描，如图1所示，待测化合物分子离子精确质量数为329.23331，且质谱响应值达到7.63×10⁷，通过查找待测化合物分子质量，可得出质谱扫描模式为[M＋H]^－离子模式；再结合图1优化得出最佳质谱参数，其中，鞘气流速25 arb；辅助气流速5 arb；离子源温度350 ℃；喷雾电压－3.2 kV；HESI负离子模式；Full MS/dd-MS2扫描模式；扫描范围m/z 100～500；碰撞能量为15 eV。

2 UPLC条件优化

UPLC色谱柱选择

由图2可知，结合Hypersic Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Accucore aQ色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）液相色谱柱对待测物及内标物进行有效分离通过仪器分析所得色谱图峰面积响应值可知，Hypersic Gold色谱柱分离效果较好，且色谱峰面积响应高于Accucore aQ色谱柱，故选择Hypersic Gold色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。

流动相选择

考察甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3 种流动相体系下分别对标准溶液和基质样品溶液中待测物组分进行色谱分离效果分析。结果发现，甲醇-0.1%甲酸溶液尚未有效分离基质样品中待测物组分，无法满足实验需求。乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液可有效分离样品中待测物成分，同时待测物经色谱柱分离后出峰较早，有可能该物质尚未完全在色谱柱上保留，故不选择该流动相组合。乙腈-0.1%甲酸溶液可有效分离样品中待测物成分，出峰时间晚于乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液，说明待测物在色谱柱中可充分保留后被流动相所洗脱，其分离色谱图见图3；其次，由图4、5可知，通过Mass Frontier 8.0软件推测，并结合其实际二级质谱图，确认其二级特征碎片离子，故可用于后续实验上机分析。综上所述，选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为该方法所用流动相组合。

UPLC梯度洗脱程序优化

由表2和图6可知，在洗脱程序2下待测物标准溶液（20 ng/mL）色谱峰面积响应高于其他2 种洗脱程序，且峰形较好，同时该洗脱程序仅需11 min便可完成样品的上机分析，可满足实验耗时短且检测效率高的要求。

3 前处理方法优化

依次选取甲醇、乙醇、53%乙醇溶液、超纯水对基质样品直接稀释后进样分析，分析结果见图7，经乙醇稀释处理后待测物色谱峰面积响应高于其他溶剂，同时经超纯水稀释处理后内标物未能被有效检测，可能是内标物未溶于超纯水中。

4 线性范围、方法检出限及定量限结果

为了消除基质效应对定量结果的影响，在待测样品及标准工作系列溶液中添加9-hydroxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic-9,10,12,13-D₄ acid稳定同位素物质作为内标标准溶液，实验采用同位素内标法进行定量分析。在以上条件下，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL标准工作系列溶液，过膜上机分析，该标准工作曲线方程为Y=0.245529＋0.347984X，且线性良好（R²=0.9997），可用于后续定量分析。以仪器信噪比（R_SN=3）确定待测物的检出限（LOD）为0.2 ng/mL，同时确定定量限（LOQ，R_SN=10）为0.5 ng/mL。

5 回收率与精密度

量取待测物含量已知的53%酱香白酒，分别添加5、15、20 ng/mL 3 个添加量水平的三羟基十八烯酸化合物标准溶液。按照所优化建立的检测方法进行测定。每份样品平行测定6 次，考察方法的回收率及精密度。如表3所示，其在基质样品中方法回收率为83.40%～103.55%，RSD为2.14%～6.89%，可见该方法具有良好的可靠性。

6 不同发酵轮次基酒中呈苦味三羟基十八烯酸测定

选取2021年度生产的7 个发酵轮次下基酒酒样进行呈苦味三羟基十八烯酸含量测定，分析结果见表4。研究发现酱香型白酒生产过程中不同发酵轮次间基酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量在60.11～224.75 ng/mL范围之间，第1轮次基酒酒样中其含量最低（60.11 ng/mL），第6轮次基酒酒样中含量最高（224.75 ng/mL），分别与其他5 个发酵轮次间差异显著。此外，第2轮次与第3轮次基酒酒样间差异不显著，同样，第5轮次与第7轮次基酒酒样间差异不显著，但第5轮次和第7轮次基酒酒样中含量要高于第2轮次与第3轮次中含量。

7 不同典型体基酒中呈苦味三羟基十八烯酸测定

目前，酱香型白酒的主要典型体分为酱香、醇甜香、窖底香3 种类型，对2020年度生产的不同典型体基酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量进行测定，分析结果见图8。3 个典型体下其含量差异显著，且在醇甜香典型体基酒中其质量浓度最高，达到424.91 ng/mL；酱香典型体基酒中质量浓度为247.58 ng/mL，显著低于其他典型体基酒等级。

8 不同贮存时间基酒中呈苦味三羟基十八烯酸测定

选取不同贮存时间的基酒样品，测定其中呈苦味三羟基十八烯酸含量，分析结果见图9。贮存3 a与1 a的基酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量显著低于其他时间，且贮存2 a的基酒中呈苦味三羟基十八烯酸质量浓度最高（435.71 ng/mL），由此可见，不同贮存时间基酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量无变化规律，这可能是基酒在贮存过程中不会再有新的呈苦味三羟基十八烯酸生成。

9 结论与讨论

优化了UltiMate 3000高效液相色谱串联QE Focus高分辨质谱仪，同时结合HESI负离子扫描模式以及Full MS/ddMS2采集模式下内标法定性定量测定白酒中呈苦味三羟基十八烯酸含量的检测方法。利用Hypersic Gold（100 mm×2.1 mm，1.9μm）液相色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸溶液的流动相组合经梯度洗脱后有效分离待测物成分，结果显示该方法标准工作曲线线性良好（R²=0.9997），具有较好的回收率和精密度，同时稳定性较好，可满足实际样品的检测要求。

随着发酵时间的延长，酿酒高粱中亚油酸可能被氧化分解成呈苦味三羟基十八烯酸含量逐渐增加，进而在蒸馏过程中随蒸汽迁移入基酒；选取不同贮存时间基酒酒样中呈苦味三羟基十八烯酸含量并无明显变化规律，这可能是在贮存过程中缺少亚油酸被氧化分解成三羟基十八烯酸所需的酶类。鉴于酱香型白酒受生产周期所限，本实验所选用发酵轮次基酒酒样为上年度贮存样品，这限制了进一步分析酒醅中亚油酸含量与基酒酒样中呈苦味三羟基十八烯酸之间的相关性，后续研究中可通过实时跟踪酱香型白酒生产过程以深入探究二者之间的关联性；此外，探讨完善白酒中三羟基十八烯酸的苦味阈值范围，通过适当调整白酒生产工艺以控制酒体中呈苦味三羟基十八烯酸的含量。

本文《呈苦味三羟基十八烯酸UPLC-HRMS测定方法优化及其在白酒检测中的应用》来源于《食品科学》2023年44卷08期252-359页。作者：杨军林，田栋伟，尹艳艳，蒋力力，黎露露，张二康，胡峰，程平言. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220614-140.