贵州大学董晓庆副教授等：基于UPLC-MS/MS的不同产地蜂糖李果实初生代谢差异分析
2023-07-08作者：来源：责任编辑：食品界
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蜂糖李是贵州农产品地理标志水果，具有果大味甜、肉质酥脆、香味浓郁、营养丰富等优点而深受消费者青睐。蜂糖李果实色泽鲜艳、质优味美，虽价格较高，但仍供不应求。故市场中频繁出现蜂糖李品质参差不齐的现象，违法者以次充好损害消费者利益，严重破坏市场秩序与原产地产品的价值，进而影响产品销售和品牌推广。
代谢组学是研究生物体内内源性代谢产物及其变化规律的一门学科，是系统生物学的重要组成部分，其主要研究对象是相对分子质量小于1 000的小分子代谢产物，包括有机酸、氨基酸、脂类、糖醇类化合物等物质。目前，基于超高效液相色谱-串联质谱的广泛靶向代谢组学技术具有优良的色谱分离度、高灵敏度及高分辨率而被广泛用于食品科学、医学和植物学等多个领域。然而，目前关于不同产地蜂糖李的代谢组学研究鲜见报道。 贵州大学农学院张琴，董晓庆*、林欣等人通过用UPLC-MS/MS的广泛靶向代谢组学技术对贵州省3个不同产地的蜂糖李果实进行代谢物比较分析，探究产地对蜂糖李初生代谢物及代谢途径的影响，并从差异代谢物的角度着手，筛选对区分3个蜂糖李产地有重要作用的差异代谢物，以期为蜂糖李产地鉴别及溯源提供数据支持和理论参考。
01 不同产地蜂糖李代谢组成分总体分析
3 个产地共鉴定出6 类307 种代谢物（表1），其中脂质78 种，氨基酸及其衍生物75 种，有机酸54 种，糖及醇类47 种，核苷酸及其衍生物41 种，维生素12 种。惠水地区鉴定出306 种代谢物，六马地区鉴定出299 种代谢物，良田地区鉴定出300 种代谢；3产地蜂糖李共有的代谢物296 种，惠水地区独有的代谢物有5 种（S-烯丙基-L-半胱氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸、2-氨基嘌呤、溶血磷脂酰胆碱15:1、溶血磷脂酰胆碱16:2）。PCA和聚类分析
对3 个不同产地蜂糖李果实的总代谢物进行PCA（图1A），PC1的贡献率为41.56%，PC2的贡献率为23.58%。各组蜂糖李样本内部聚集在一起，不同产地间分离趋势明显，从PCA结果上总体反映了蜂糖李不同产地间的代谢物差异。聚类分析表明（图1B），不同产地蜂糖李存在明显的分组模式，良田蜂糖李和六马蜂糖李的代谢物种类与含量较为接近，聚为同一类；惠水蜂糖李单独聚在一类，与良田、六马蜂糖李差异较大。结合PCA和聚类分析共同表明，3 个不同产地的蜂糖李果实具有不同的代谢特征。
分别对六马蜂糖李、良田蜂糖李和惠水蜂糖李进行两两比较，由OPLS-DA得分图 （图2A1、B1、C1）可知，LM vs HS的PC1贡献率为55.80%，PC2贡献率为13.50%；LM vs LT的PC1贡献率为48.60%，PC2贡献率为13.90%；LT vs HS的PC1贡献率为58.60%，PC2贡献率为9.18%，各比较组均表现出较明显的分离趋势。OPLS-DA 模型验证（图2 A2、B2、C2）表明LM vs HS组
值，分别为0.693、1、0.968；LM vs LT组值，分别为0.626、1、0.948；LT vs HS组值，分别为0.678、1、0.962。各组OPLS-DA模型的评价参数中各指标均大于0.5且Q2＞0.9，说明模型构建良好，预测性可靠。为避免过拟合，对OPLS-DA模型进行置换检验（n=200，即进行200 次排列实验），实验结果显示，模型有意义，不存在过拟合现象，可根据VIP值分析筛选其差异代谢物。不同产地蜂糖李差异代谢物的筛选
根据OPLS-DA结果，一般以VIP≥1，FC≥2或FC≤0.5为标准筛选出显著差异代谢物。差异代谢物筛选结果如图3、表2所示，LM vs HS筛选到49 种差异代谢物，包括14 种氨基酸及其衍生物、8 种核苷酸及其衍生物、25 种脂质、2 种有机酸，其中上调的物质45 种，占91.84%；下调物质4 种，占8.16%。LM vs LT筛选到13 种差异代谢物，包括5 种氨基酸及其衍生物、2 种核苷酸及其衍生物、3 种脂质、2 种糖及醇类和1 种有机酸，其中上调表达的物质有8 种，占比61.54%；下调表达物质5 种，占比38.46%。LT vs HS筛选到49 种差异代谢物，包括脂质18 种、氨基酸及其衍生物15 种、核苷酸及其衍生物10 种、糖及醇类2 种、脂质2 种及有机酸2 种，其中43 种物质上调，占比为87.76%；6 种物质下调，占比为12.24%。 对显著差异代谢物进行热图分析，结果如图4所示，图中红色区域代表差异代谢物的高表达区，绿色区域代表差异代谢物的低表达区。在LM vs HS比较组中（图4A），惠水蜂糖李差异代谢物主要集中在红色的高表达区域，而六马蜂糖李差异代谢物则主要集中在绿色的低表达区域，惠水蜂糖李中有4 种（10-十七碳烯酸、L-缬氨酰-L-亮氨酸、脱落酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）差异代谢物的表达量显著低于六马蜂糖李；惠水地区的45 种差异代谢物的表达量要明显高于六马地区，多数为脂质类物质。其中溶血磷脂酰胆碱类物质的含量变化与疾病类型和严重程度密切相关。
在LM vs LT比较组中（图4B），良田蜂糖李中有8 种（L-脯氨酰-L-亮氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、D-(－)-苏阿糖、1-(sn-甘油-3-磷酸)-1D-肌醇、3-羟基苯甲酸、甘磷酸胆碱GPC、溶血磷脂酰胆碱18:0（2n异构））差异代谢物的表达量明显高于六马蜂糖李，且主要集中在红色的高表达区，多为氨基酸类物质、糖及醇类物质，其中S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸和 3-羟基苯甲酸的表达量较高，含有半胱氨酸的小分子肽具有较高的抗氧化活性。良田蜂糖李有5 种（N-甲基甘氨酸、L-色氨酸、腺苷、环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、2R-羟基十八烷酸）差异代谢物的表达量明显低于六马蜂糖李，且主要集中在绿色的低表达区域，说明良田地区蜂糖李差异代谢物的含量积累更高，代谢更为活跃。值得注意的是，LM vs LT的差异代谢物只有13 种，明显少于其他两组。
在LT vs HS比较组中（图4C），惠水蜂糖李差异代谢物主要集中在红色的高表达区，而良田蜂糖李则主要集中在绿色的低表达区，表明惠水地区的蜂糖李样品中差异代谢物的含量普遍高于良田地区，惠水蜂糖李样品中的差异代谢物，其代谢机能更为活跃。此外，通过差异代谢物热图分析发现，产地对蜂糖李果实中各类代谢物的含量和种类具有显著影响，而差异代谢物是众多代谢物中因产地不同而引起含量明显变化的物质，因而差异代谢物对于蜂糖李产地鉴别具有一定的参考意义。 
如图5所示，特有差异代谢物以LM vs HS最多为10 种，LT vs HS次之9 种，LM vs LT最少3 种。由表3可知，LM vs HS的特有差异代谢物主要以脂质和氨基酸及其衍生物类物质为主，其中L-丙氨酰-L-亮氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、1-亚麻酰单甘油酯-二葡萄糖苷、溶血磷脂酰乙醇胺17:1、溶血磷脂酰乙醇胺18:0、溶血磷脂酰胆碱17:2、溶血磷脂酰胆碱18:0、溶血磷脂酰胆碱20:2含量在惠水蜂糖李中显著上调，为六马蜂糖李的1.95～3.03 倍；而L-缬氨酰-L-亮氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量在惠水蜂糖李中显著下调，不及六马的1/2。由表4可知，LM vs LT的特有代谢物有3 种，良田蜂糖李中1-(sn-甘油-3-磷酸)-1D-肌醇和L-脯氨酰-L-亮氨酸的含量显著上升；而腺苷含量则显著下降。由表5可知，LT vs HS的特有代谢物有9 种，包括氨基酸及其衍生物类、核苷酸及其衍生物、糖及醇类物质，其中L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、腺嘌呤、L-酪氨酸、N6-乙酰-L-赖氨酸、N-单甲基-L-精氨酸、黄苷等物质的含量在惠水蜂糖李中上调表达，为良田蜂糖李的1.41～2.54 倍；下调的代谢物有2 种，分别为己二烯二酸、D-半乳糖二酸，且仅为良田的1/4～1/2。以上分析发现各组间的特有差异代谢物也在含量上差异显著，进一步说明了产地对蜂糖李果实代谢物含量的重要影响。 
04 紫外吸收光谱分析结果
3 个蜂糖李产地间的差异代谢物KEGG富集分析结果如图6所示，LM vs HS中的差异代谢物共分布于38 条代谢通路（图6A），其中显著差异代谢通路有4 条（P＜0.05），分别为氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢和玉米素生物合成途径。惠水相较于六马蜂糖李，氨基酰-tRNA生物合成途径有5 种差异代谢物参与，均为氨基酸及其衍生物包括L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸，惠水蜂糖李中L-甲硫氨酸显著上调了3.77 倍。此结果有利于惠水地区开发和生产富含L-甲硫氨酸的蜂糖李。氨基酸生物合成途径有7 种氨基酸及其衍生物参与，分别为L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸均在惠水蜂糖李中显著上调，其中S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸是惠水蜂糖李独有的差异代谢物，可作为判别惠水蜂糖李的标志性代谢物。半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径有4 种差异代谢物参与，包括3 种氨基酸（L-甲硫氨酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸）和1 种核苷酸及其衍生物（5-脱氧-5-甲硫腺苷）。玉米素生物合成途径有3 种差异代谢物参与，包括2 种核苷酸及其衍生物（5-脱氧-5-甲硫腺苷、尿苷-5’-二磷酸）和1 种氨基酸及其衍生物（S-腺苷-L-蛋氨酸）。以上分析表明，氨基酸类物质参与多条代谢通路，说明不同产地对蜂糖李代谢中的氨基酸及其衍生物具有一定影响，且同一代谢物同时参与多条代谢通路，映射出的差异代谢物对通路影响较大。 LM vs LT中的差异代谢物共分布于18 条代谢途径（图6B），其中显著差异代谢通路有3 条（P＜0.05），分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径和醚脂代谢途径。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径有2 种差异代谢物参与，分别为1 种有机酸（3-羟基苯甲酸）和1 种氨基酸及其衍生物（L-色氨酸），其中3-羟基苯甲酸显著上调3.80 倍；L-色氨酸在六马蜂糖李中积累量更多，上调2.26 倍。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径有2 种氨基酸及其衍生物参与分别是N-甲基甘氨酸和L-色氨酸，其中N-甲基甘氨酸是六马蜂糖李特有代谢物，可作为判别六马蜂糖李的标志性代谢物；L-色氨酸参与的代谢通路有3 条，说明该差异代谢物是处于多条代谢通路的交集处，对通路的影响较大。醚脂代谢途径有1 种脂质（甘磷酸胆碱GPC）参与，表明甘磷酸胆碱GPC在良田蜂糖李中代谢更为活跃，为六马蜂糖李的2.62 倍。 LT vs HS中的差异代谢物共参与48 条代谢途径（图6C），显著差异代谢通路有5 条（P＜0.05），分别为氨基酰-tRNA生物合成、硫代葡萄糖苷的生物合成、2-氧羧酸代谢、硫胺代谢和氨基酸生物合成途径。其中氨基酰-tRNA生物合成途径共有8 种氨基酸及其衍生物参与，分别为L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸在惠水蜂糖李中代谢更为活跃，含量更高，为良田蜂糖李的2.92～3.53 倍；L-酪氨酸的代谢则在良田产地中更旺盛，积累量更多，为惠水蜂糖李的3.70 倍。硫代葡萄糖苷的生物合成途径有5 种氨基酸及其衍生物参与，L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸。2-氧羧酸代谢途径有6 种差异代谢物参与，分别为L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸，其中L-赖氨酸是人体必需氨基酸。氨基酸生物合成途径有8 种差异代谢物参与，分别为L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸，表明这类物质在氨基酸生物合成途径中代谢活跃。硫胺代谢途径仅有1 种核苷酸及其衍生物（烟酸腺嘌呤二核苷酸）参与，惠水蜂糖李的烟酸腺嘌呤二核苷酸代谢更为活跃，含量更高，是良田蜂糖李的2.28 倍。代谢通路分析发现L-异亮氨酸*、L-亮氨酸*、L-甲硫氨酸、L-色氨酸等参与了多条代谢通路，说明这些物质对代谢通路影响较大，处于复杂的网络代谢通路的节点上，是连接各通路的枢纽。此外，分析发现良田蜂糖李和惠水蜂糖李在代谢中最大的差异是氨基酰-tRNA生物合成和氨基酸生物合成代谢过程，说明产地对蜂糖李中氨基酸类物质的影响较大，但其受产地影响的机理目前尚不明确。
结 论
基于UPLC-MS/MS代谢组学技术对不同产地蜂糖李初生代谢产物进行研究，3 个产地共鉴定出307 种代谢物，LM vs HS、LM vs LT和LT vs HS分别鉴定出49、13、49 种显著差异代谢物，各占总代谢物的15.97%、4.23%、15.97%，且主要以上调为主，说明不同产地的蜂糖李代谢物质差异显著。产地不同，不同代谢物的种类和含量存在显著差异，其差异代谢物可作为蜂糖李产地区分的参考依据。KEGG代谢通路分析发现，显著富集的代谢通路主要为氨基酸类代谢通路，而产地对蜂糖李中氨基酸类物质的影响最为显著，且不同产地间蜂糖李代谢差异机制主要在于氨基酸类物质的代谢，说明氨基酸类代谢途径对研究产地对蜂糖李果实品质的影响具有重要指导意义。 本文《基于UPLC-MS/MS的不同产地蜂糖李果实 初生代谢差异分析》来源于《食品科学》2023年44卷8期284-292页，作者：张 琴，董晓庆，林 欣，彭俊森，罗登灿，黄世安，朱守亮。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20220401-014.。
