食品界

郑州轻工业大学食品与生物工程学院李可副教授等：等离子体活化水对腐败希瓦氏菌杀菌效果及机理

等离子体活化水（PAW）是指低温等离子体在水中或水面上放电后，等离子体产生的离子与水分子相互作用，引发化学反应，产生富含活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等活性成分的水溶液。PAW对不同类型的微生物具有不同的杀菌效果，一般来说，PAW更易灭活革兰氏阴性菌。腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一种革兰氏阴性菌，是海产品贮藏过程中的优势腐败菌之一，它的生长繁殖会对产品品质造成不良影响。因此，对S. putrefaciens的灭活成为研究的热点。

郑州轻工业大学食品与生物工程学院刘骁、李可*等人以S. putrefaciens为研究对象，通过对细胞膜通透性、细菌形态变化等指标进行分析，探究PAW对S. putrefaciens的灭活效果及机理，以期为PAW在水产品中的应用提供理论依据。

1.PAW处理对S. putrefaciens的杀菌效果

等离子体放电时间对S. putrefaciens活菌数的影响如图1所示，与对照组相比，随着等离子体放电时间的延长，PAW处理S. putrefaciens的活菌数量对数值显著下降（P＜0.05），放电60、90、120、150 s制备的PAW处理菌悬液3 min后，菌落数对数值分别减少至5.79、5.05、4.74、4.47（lg（CFU/mL）），与对照组相比，PAW120处理后的菌落总数下降超过99%，但和PAW150处理组没有显著性差异。PAW中的RNS也参与了细菌失活，RNS的产生降低了PAW的pH值，提高了微生物对其的敏感性。

PAW处理时间对S. putrefaciens活菌数的影响如图2所示，经PAW120处理1.5、3.0、4.5 min和6.0 min后，S. putrefaciens活菌数量对数值显著减少（P＜0.05），分别减少了3.69、4.51、5.76（lg（CFU/mL））和7.44（lg（CFU/mL））。综上，PAW具有一定的杀菌效果。

2.PAW处理对S. putrefaciens蛋白和核酸释放量的影响

经PAW120处理不同时间后S. putrefaciens胞外蛋白释放量如图3所示，与对照组相比，经PAW120处理后S. putrefaciens上清液中蛋白质量浓度逐渐增加，且当处理6 min后胞外蛋白质量浓度显著增加到0.34 mg/mL（P＜0.05），经过PAW120处理不同时间后，上清液中核酸质量浓度也有类似变化趋势，如图4所示，与对照组相比，经PAW120处理1.5、3.0、3.5 min和6 min后，S. putrefaciens上清液中核酸质量浓度分别显著增加到21.31、22.42、23.64、23.97 μg/mL（P＜0.05）。研究表明，PAW中含有大量的活性物质，如H2O2、O3、NO2－、NO3－等，它们可以渗透到细胞内，造成细胞内核酸、蛋白质等物质的氧化损伤，进而诱导细胞发生氧化应激反应，导致细胞的正常生理活动受到破坏。

3.PAW处理对S. putrefaciens细胞形态的影响

PAW处理S. putrefaciens后细胞形态变化如图5所示，未处理的S. putrefaciens呈棒状，表面光滑、形态完整，而经PAW120处理1.5 min后，细胞表面出现轻微的皱缩。随着处理时间的延长，细胞表面皱缩严重，处理6 min后细菌细胞有明显的内容物泄漏。这些结果表明，PAW处理能够造成细胞损伤、形态变化、胞外蛋白和核酸含量升高，进而影响细胞的代谢生长，导致菌体死亡。

4.PAW处理对S. putrefaciens细胞外膜通透性的影响

N-苯基-1-萘胺（NPN）是一种中性疏水荧光探针，在水环境中表现为低荧光强度，但在非极性或疏水环境中（如磷脂）荧光强度增加。正常情况下，革兰氏阴性菌细胞外膜上的磷脂双分子层将NPN隔离在外，当细胞外膜受损时，NPN进入到内膜与外膜之间的疏水环境中发出荧光。PAW对S. putrefaciens细胞外膜通透性的影响如图6所示，随着PAW120处理时间的延长，NPN相对荧光强度显著增加（P＜0.05），与对照组相比，处理1.5、3.0、4.5 min和6.0 min后NPN相对荧光强度分别增加了275.49%、320.34%、369.60%和474.51%，表明经PAW120处理后S. putrefaciens细胞外膜遭到了破坏。
5.PAW处理对S. putrefaciens细胞质膜通透性的影响

PI只能进入细胞质膜受损的细胞，在细胞内与核酸结合并产生红色荧光，因此，可以用PI荧光强度评价细胞质膜的通透性。PAW对S. putrefaciens细胞质膜通透性变化如图7所示，随着处理时间的延长，PI相对荧光强度逐渐增加，与对照组相比，处理1.5、3.0、4.5 min和6.0 min后PI相对荧光强度分别增加了841.24%、925.24%、951.22%和989.31%，结果表明经PAW120处理后细菌细胞膜通透性显著增加（P＜0.05）。

6.PAW处理对S. putrefaciens电导率的影响

PAW120处理对S. putrefaciens细胞电导率的影响如图8所示。与对照组相比，随着PAW120处理时间的延长，细菌电导率显著增加（P＜0.05），经PAW120处理1.5、3.0、4.5 min和6.0 min后，电导率分别增加到7.52、7.56、7.68 mS/cm和7.91 mS/cm。
7.PAW处理对S. putrefaciens细胞膜电位的影响

膜电位在调节细菌的生理和行为中发挥重要的作用，如能量转化、pH值稳态、主动转运和环境感知。DiBAC4(3)是一种膜电位染料，只能进入去极化细胞，通过与富含脂质的细胞内成分结合而增强荧光。S. putrefaciens细胞膜电位变化如图9所示，与对照组相比，随着处理时间的延长，DiBAC4(3)相对荧光强度显著增加（P＜0.05），处理6 min后，相对荧光强度达到2 329.77%。Mai-Prochnow等发现，PAW中的ROS/RNS能够破坏细菌细胞的许多成分，包括DNA、RNA、膜成分（脂质）和蛋白质。以上结果表明，PAW处理能够诱导细菌膜去极化，干扰细胞代谢，最终导致S. putrefaciens细胞死亡。
8.PAW处理后腐败希瓦氏菌的分子结构

傅里叶变换红外光谱可以反映PAW120处理后S. putrefaciens分子组成的变化，进而间接地表征PAW120对S. putrefaciens死亡诱导机制，其中3 300～2 800、1 237、1 445、1 546、1 650 cm－1处谱带分别代表分子中的脂质、磷酸二酯、结构蛋白、酰胺II带的N H键、酰胺I带的C＝O键。PAW120处理对S. putrefaciens的傅里叶变换红外光谱如图10所示，经PAW120处理后，与对照组相比，2 996、2 850、1 650、1 537、1 454 cm－1和1 236 cm－1处的吸收峰强度发生明显变化。根据先前报道可知，1 650、1 537、1 454 cm－1的吸收峰强度变化可能与细胞生长有关，这种现象可能是膜蛋白二级结构改变所致。而1 236 cm－1处吸收峰强度增加，2 996、2 850 cm－1处吸收峰强度明显下降，表明PAW120处理破坏了S. putrefaciens细胞膜的磷脂双分子层。以上结果表明，PAW120通过破坏S. putrefaciens细胞膜抑制细菌生长繁殖。Wang Xiaolong和Yusupov等报道，ROS（特别是·OH和H2O2）可能会破坏肽聚糖分子结构，导致细胞壁破裂。此外，PAW中的ROS进入微生物细胞，通过破坏DNA、蛋白质和细胞的其他内部成分造成细胞内部损伤。

结论
PAW处理能够有效杀灭S. putrefaciens，且其杀菌效果能随着低温等离子体放电时间和处理时间的延长而增强。随着PAW120处理时间的延长，S. putrefaciens光滑完整的菌体发生裂解、细胞形态受损，胞内蛋白和核酸大量泄漏，表明PAW可以破坏菌体的细胞壁、增加细胞膜的通透性，从而导致细胞无法正常进行生命活动而死亡。由傅里叶变换红外光谱分析可知，经PAW120处理后，S. putrefaciens细胞膜中的功能大分子结构发生变化，这与细胞膜通透性增加结果相印证，进一步证明了PAW120对S. putrefaciens的杀菌机理。今后将对PAW对水产品感官品质及营养成分的影响进行进一步探索，以期为PAW在水产品中的应用提供理论依据。

本文《等离子体活化水对腐败希瓦氏菌杀菌效果及机理》来源于《食品科学》2023年44卷第9期25-31页，作者：刘骁，孟茜，张明莉，李可，赵卫东。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220520-264。