食品界

江西师范大学张露教授等：覆盆子单宁富集组分消化稳定性及对肠道菌群的调节作用

多酚类化合物是广泛存在于植物中的次级代谢产物，具有良好的抗氧化、抗衰老、抗菌、抗癌、降血脂和提高机体免疫力等功能。单宁又称单宁酸或鞣酸，是中高度聚合的多酚类化合物，可分为水解单宁和缩和单宁，两者常共存于植物组织中。水解单宁能被酸、碱和特定的酶水解,是由葡萄糖和没食子酸或鞣花酸形成的多元酯类化合物，包括没食子酸吡喃葡萄糖、没食子单宁、鞣花单宁及它们的衍生物。覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子（Rubus chingii Hu）的未成熟干燥果实，含有丰富单宁类化合物，约占总多酚的75%。但覆盆子单宁经胃肠道消化后的稳定性、活性变化及其对肠道菌群的调节作用尚不明确。

江西师范大学生命科学学院贾晓燕、胡朋朋、张露*等从覆盆子中提取富集单宁，通过体外模拟消化模型探究覆盆子单宁富集组分消化前后单宁含量及抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性变化，通过体外厌氧发酵模型分析模拟消化对其肠道菌群调节作用的影响，最后采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）比较体外消化和酵解产物中单宁组成及其代谢产物含量变化情况。

1.模拟胃肠道消化后覆盆子单宁富集组分水解单宁含量变化

覆盆子单宁组分经胃肠道模拟消化后的可水解单宁含量变化如表1所示。覆盆子单宁经胃模拟消化后，FGE组和FG组的可水解单宁含量较FY组显著增加（P＜0.05），分别增加了125.04%和103.73%，且两组间具有显著性差异（P＜0.05）。在胃消化过程中，消化酶和pH值环境均会影响样品中可水解单宁的稳定性，且pH值影响更大，水解单宁在酸性条件下会水解成分子质量较低的没食子单宁和鞣花单宁。经肠道模拟消化后，FIE组和FI组的可水解单宁含量较FGE、FG两组明显下降，分别下降了56.24%和66.24%（P＜0.05），表明在肠道消化过程中，覆盆子中可水解单宁的稳定性同时受消化酶和pH值环境的影响，但受消化酶的影响较小。综上，覆盆子单宁经胃肠道模拟消化后，其含量虽然在胃消化阶段会显著增加，但肠消化阶段却表现为显著下降，表明胃肠道消化过程会影响可水解单宁的稳定性，使其含量减少。

2.模拟胃肠道消化后覆盆子单宁富集组分DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力

覆盆子单宁及经胃肠道模拟消化后样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力如图2和表1所示。所有样品的DPPH自由基清除能力均随着样品质量浓度的增加而增强，FY的DPPH自由基清除能力最弱（IC₅₀＝63.57 µg/mL），FGE、FG、FIE和FI的DPPH自由基清除能力相近，为FY组的1.60～2.18 倍，胃肠消化过程会显著增强覆盆子单宁的DPPH自由基清除能力（P＜0.05），IC₅₀为为29.15～39.65 µg/mL，可能是因为覆盆子单宁胃消化过程中含量上升，导致其抗氧化活性增强。另外，所有样品均具有较好的ABTS阳离子自由基清除能力，且在质量浓度低于130 µg/mL时具有良好的剂量-效应关系，但原样与消化样品间的ABTS阳离子自由基清除能力无明显差异，IC₅₀为26.49～31.22 µg/mL，表明胃肠道模拟消化对覆盆子单宁的ABTS阳离子自由基清除能力无明显影响。

3.模拟胃肠道消化后覆盆子单宁富集组分的α-葡萄糖苷酶抑制能力

覆盆子单宁及其胃肠道模拟消化样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力如图3和表1所示，FIE组（IC₅₀＝77.66 µg/mL）和FI组（IC₅₀＝85.18 µg/mL）的α-葡萄糖苷酶抑制能力较弱，而FY、FGE和FG则具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制能力，IC₅₀分别为10.84、6.38、5.83 µg/mL，经肠道模拟消化后，样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力明显降低。以上结果表明，样品经胃模拟消化后，其抑制能力有所提升（P＜0.05），pH值的影响大于消化酶，这可能是由于在胃消化阶段，pH值环境发生改变，单宁含量增加，而经肠道模拟消化后，由于环境pH值再次发生变化，可能导致部分单宁异构化或降解为α-葡萄糖苷酶抑制能力更差的成分，使样品的酶抑制活性大幅下降。

4.体外发酵粪便样品的高通量测序结果

测序质量

随机抽取FY-CF、FI-CF、FIE-CF、FKI-CF、BK组样品所测得的序列，统计其所代表的操作分类单元（OTU）数量，并以序列数与OTU数量绘制稀释曲线，结果如图4所示，所有样品组的物种数随序列数的增加而增加，当序列数达30 000后，稀释曲线逐渐趋于平坦，说明本次测序数据量足够反映肠道菌群的多样性情况，足够体现肠道菌群中大部分的菌群组成情况。

菌群多样性及组成成分分析

根据图4中微生物的OTU数量对样品进行α多样性分析，如表2所示，各样品的Coverage指数均大于0.999，表明本次测序方法和数据可以反映肠道菌群的真实组成。FKI-CF、FI-CF和FIE-CF组的Shannon、Simpson、Ace和Chao指数相比于FY-CF组有显著性差异（P＜0.05），说明未消化的和消化后的覆盆子单宁均会对肠道菌群的多样性产生影响。FI-CF、FIE-CF和FKI-CF相比较，Simpson指数具有显著性差异，说明消化过程中的酶、pH值、消化液会影响覆盆子单宁活性，从而影响肠道菌群的丰度。

为比较微生物群落之间的差异，本实验进行了β多样性分析和主成分分析。由图5可知，FI-CF、FIE-CF、FY-CF、FKI-CF和BK组之间两两分开聚集且差异明显，说明覆盆子单宁会影响肠道微生物群的组成结构。

肠道菌群结构和组成分析

各样品基于门水平上的物种组成及相对丰度如图6A所示。5 组样品的肠道菌群均以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，其中BK组上述4 个优势菌门相对丰度分别为47.68%、31.94%、11.16%、8.01%。与BK组比较，覆盆子单宁经模拟消化后Firmicutes相对丰度增加（38.20%），Actinobacteriota、Bacteroidetes和Proteobacteria的相对丰度分别降低24.44%、63.12%、69.88%，未消化的FY-CF组除Actinobacteriota的相对丰度（15.95%）增加外，其他优势菌门的相对丰度变化趋势与消化后的覆盆子单宁组一致。另外，厚壁菌门中含产丁酸菌，说明覆盆子单宁可促进丁酸的产生。

各样品基于属水平上的物种组成及相对丰度如图6B所示。在属水平上相对丰度排前15的菌属包括不动杆菌属（Agathobacter）、拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、粪便杆菌属（Faecalibaterium）、布劳特氏菌属（Blautia）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、厌氧原体属（Asteroleplasma）、巨单胞菌属（Megamonas）、Dorea、Alistipes、产气柯林斯菌属（Collinsella）、类杆菌属（Parabacteroides）、Parasutterella和丁酸弧菌（Anaerostipes）。相对丰度前5的Agathobacter、Bifidobacterium、Faecalibaterium、Blautia、Ruminococcus在FY-CF、FI-CF、FIE-CF和FKI-CF组中相对丰度均高于BK组，其中Agathobacter和Faecalibaterium具有显著性差异（P＜0.05），而Bacteroides相对丰度则显著低于BK组（P＜0.05）。Faecalibaterium在FY-CF、FI-CF和FIE-CF组中的相对丰度分别较BK组增加1.81%、6.32%和6.45%（图7C）。作为益生菌的Bifidobacterium其相对丰度在单宁样品组中均高于BK组（图7B）。FI-CF、FIE-C和FKI-CF组中Ruminococcus的相对丰度相比BK组增加0.68%、1.21%和3.06%，而在FY-CF组中降低0.74%（图7D），说明经过消化后的单宁组分更有助于Ruminococcus增殖，推测可能在消化过程中单宁组分产生新的能被Ruminococcus利用的物质。与BK组比较，Anaerostipes在FY-CF组相对丰度增加2.08%，在FI-CF、FIE-CF组中分别增加0.72%和2.38%（图7A）。此外，我们还发现单宁富集组分显著增加了Coprococcus的相对丰度，FY-CF、FI-CF和FIE-CF组中Coprococcus的相对丰度相比BK组分别增加1.24%、0.63%和1.07%（图7E）。以上研究结果显示，覆盆子单宁对人体肠道菌群中有益菌的丰度和多样性均有显著的促进作用，而相比未消化的覆盆子单宁，消化后的覆盆子单宁对肠道菌群中有益菌生长的影响较小，说明胃肠道消化过程会影响覆盆子单宁的活性，从而影响其在人体内发挥作用。

5.覆盆子单宁胃肠消化稳定性及肠酵解特性

通过将获得的母离子、离子碎片的准确分子质量以及它们的特征碎片模式与参考文献、Scifinder和Metlin数据库中记录的数据进行匹配，对化合物的结构进行鉴定，以母离子的峰面积作为参照表示不同样品之间单宁代谢物相对含量的变化。覆盆子单宁富集组分（FY）和体外结肠发酵后（FY-CF）两个样品的总离子流图如图8所示，鉴定的化合物信息如表3所示。在FY中检测到了8 种单宁类化合物，其中峰1、8、12、13和18的母离子相同，[M－H]－为m/z 633.072 4，具有特征碎片m/z 463.044 6（[M－H－170]－）、m/z 301.001 7（[MH－332]－），表明存在没食子酸（m/z 301）、六羟基联苯二甲酰基（HHDP）和葡萄糖基部分（m/z 463.044 6），推断为没食子酰基六羟基联苯二甲酰基葡萄糖或其异构体；峰2、14、15、17、22、26和30推断为赤芍素/木麻黄鞣宁异构体，[M－H]－为m/z 783.071 6，二级碎片m/z 481.056 9为母离子失去1 个HHDP基团所产生，碎片m/z 300.998 0为[HHDP－H]－；峰5、27、32、34和37也具有相同的母离子，[M－H]－均为m/z 935.085 4，推测二级碎片m/z 633.0823和m/z 300.996 8为木麻黄鞣宁（C41H28O26）及其同分异构体；峰7、20和29（m/z 1 103.092 1、m/z 1 103.091 1、m/z 1 018.523 3），均具有特征碎片m/z 633.073 7，推断为缩合单宁类化合物；峰4、31和38（m/z 467.037 1）的母离子相同，具有二级特征碎片m/z 300.995 1，推断为鞣花酸衍生物；推断峰23和25为鞣花酸已糖苷（m/z 477.0313）；峰28、33和35为鞣花酸戊糖苷（m/z 433.0415，）；峰36为鞣花酸（m/z 300.9988）。

鞣花酸的转化路径为鞣花酸→UroD→UroC→UroB→UroA，UroA为最终代谢产物，在FY-CF中检测到3 种尿石素类化合物，根据张建伟的报道，同时结合质谱相关数据，可以推断出峰3、9和16为UroB及其同分异构体（m/z 221.04，C13H8O3）；峰10为UroA（m/z 227.01，C13H8O4）；峰11、19、21和24为UroD及其同分异构体（m/z 259.07，C13H8O6）。

由于胃肠消化及肠道微生物对覆盆子单宁组成有显著影响，如图9、表3所示，覆盆子单宁经胃模拟消化后，FGE组和FG组中的没食子酰基六羟基联苯二甲酰基葡萄糖、赤芍素/木麻黄鞣宁异构体、鞣花单宁及木麻黄鞣宁等8 种单宁类化合物的峰面积较FY组显著增加，其中，鞣花酸衍生物、木麻黄鞣宁、鞣花单宁和鞣花酸已糖苷相对含量分别增加45.33%、19.16%、66.28%和53.03%，表明在胃消化过程中，覆盆子中可水解单宁的稳定性受到消化酶和pH值的影响，但消化酶对其影响更小。经肠道模拟消化后，FIE组和FI组的8 种单宁代谢物的峰面积较FGE、FG两组明显下降，相比FGE组，FIE中鞣花酸衍生物、鞣花单宁、鞣花酸戊糖苷以及没食子酰基六羟基联苯二甲酰基葡萄糖的相对含量分别下降67.48%、55.58%、78.32%和6.84%，可能是由于pH值环境的改变导致部分可水解单宁发生降解。

鞣花单宁在肠道中被水解为鞣花酸，通过失去其中一个内酯和连续去除羟基，鞣花酸进一步被结肠中的微生物转化成尿石素。通过对比母离子、碎片离子的准确分子质量及其特征碎片模式，在FY-CF、FI-CF、FIE-CF样品中发现了尿石素，结果如表3所示。在FY-CF中，可以检测出UroA、UroB、UroC以及UroD，而在FI-CF和FIE-CF中只检测到了UroA和UroB，并且其峰面积下降显著，FI-CF、FIE-CF样品中UroA的峰面积分别下降53.37%和85.36%，而UroC和UroD几乎没有检出。综上，覆盆子单宁经胃肠道模拟消化后，单宁含量在胃消化阶段会明显增加，肠消化阶段却显著下降，表明胃肠道消化过程会影响覆盆子单宁的稳定性，使其含量显著降低。

结论

通过研究覆盆子单宁富集组分的体外模拟消化和结肠发酵特性发现，水解单宁含量经胃消化后显著增加，肠消化后显著降低。胃和肠消化后，组分的DPPH自由基清除能力相近，均显著强于消化前，而ABTS阳离子自由基清除能力无显著差异，胃消化样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性为消化前的7.16～7.86 倍，但经过肠消化后活性大大降低。体外酵解研究发现，覆盆子单宁可改变肠道菌群的组成，促进Agathobacter、Bifidobacterium、Faecalibaterium、Blautia、Ruminococcus等潜在肠道益生菌生长，而胃肠消化后的覆盆子单宁对肠道有益菌的生长也有明显的促进作用。UPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定发现，经过胃肠消化后，没食子酰基六羟基联苯二甲酰基葡萄糖、木麻黄鞣宁、鞣花酸等单宁类化合物的相对含量均呈先上升后下降的趋势，且结肠发酵后尿石素类化合物的转化率较低，仅检测到少量UroA和UroB，而UroC和UroD作为鞣花酸代谢过程的中间体未检测到。本研究可为进一步构建覆盆子单宁稳态递送体系，克服单宁本身的低转化率，提高单宁在体内或体外的生物利用率提供理论依据。

本文《覆盆子单宁富集组分消化稳定性及对肠道菌群的调节作用》来源于《食品科学》2023年44卷第9期104-113页，作者：贾晓燕，胡朋朋，王佩欣，丁翘，汪恩惠，谢作桦，涂宗财，张露。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220618-189。