食品界

FSHW | 牦牛骨胶原蛋白水解物对小鼠肠道微生物群的结构及短链脂肪酸含量的影响

Introduction

牦牛（Bos grunniens）是我国高山草原地带的特色牲畜。随着旅游业和物流业的快速发展，消费者对牦牛肉的需求也在不断增加。然而，在牦牛肉加工和生产过程中，作为副产物的牦牛骨却未得到充分利用。随着对牦牛骨成分研究的不断深入，牦牛骨胶原蛋白水解物由于具有多种生理活性而备受关注。四川大学贾冬英教授团队利用木瓜蛋白酶制备了牦牛骨胶原蛋白水解物。研究发现，牦牛骨胶原蛋白水解物具有良好的吸水性和持水能力，油脂吸收、乳化和发泡性能佳，适合在食品及化妆品领域开发应用。北京工商大学宋焕禄教授团队曾利用单一或混合蛋白酶制备牦牛骨胶原蛋白水解物并研究其生理活性。结果表明，制备的多种牦牛骨胶原蛋白水解物具有抗氧化活性和金属离子（如Cu²⁺、Ca²⁺和Fe²⁺）螯合能力。中国农业大学罗永康教授团队研究发现，牦牛骨胶原蛋白水解物能够通过提高先天免疫和适应性免疫有效预防和改善环磷酰胺诱导的BALB/c小鼠免疫抑制作用。此外，中国农业科学院张春晖研究员团队针对牦牛骨胶原蛋白水解物抗骨质疏松的作用和机制进行了深入的研究。结果表明，牦牛骨胶原蛋白水解物具有较好的促成骨细胞增殖活性，能够明显改善去卵巢大鼠骨质疏松症状，且呈现良好的剂量-效应关系。以上研究表明，牦牛骨胶原蛋白水解物具有多种生理活性，可以作为功能性成分应用于功能食品领域。

定殖在宿主肠道中的微生物在促进食物消化，维持肠道健康，调节免疫等方面发挥着重要作用。考虑到肠道微生物群对人类健康的重要性，有必要在开发功能性食品或膳食补充剂时评估它们改变肠道微生态的能力。因此，为进一步促进牦牛骨胶原蛋白水解物在功能食品领域的应用，应全面研究牦牛骨胶原蛋白水解物对肠道菌群结构的影响。在这项研究中，在为期两周的实验期间，每天通过灌胃为小鼠补充牦牛骨胶原蛋白水解物。两周后，提取粪便中的粪便细菌DNA并通过16S rRNA测序进行测序，以研究小鼠肠道菌群的改变。通过气相色谱法检测每只小鼠粪便中的SCFAs。该研究将对牦牛骨胶原蛋白水解物的功能产生新的认识，并进一步促进牦牛骨胶原蛋白水解物作为生物活性成分在功能食品开发中的应用。

Results and Discussion

牦牛骨胶原蛋白水解物的表征

本研究首先使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶联合酶解牦牛骨胶原蛋白制备了牦牛骨胶原蛋白水解物（yak bone collagen hydrolysates，YBCH）。为明确YBCH的组成，测定了YBCH中蛋白质、水分和灰分的浓度。通常，酸溶性蛋白质由游离氨基酸和肽组成。YBCH中酸溶性蛋白质和游离氨基酸的浓度分别达到（91.01±0.55）g/100 g和（3.13±0.35）g/100 g。因此，可以计算出YBCH中肽的质量百分比约为87%。显然，YBCH主要由肽组成。此外，YBCH的分子量分布通过尺寸排阻色谱柱测定。结果表明，分子量在3000 Da以下的肽段约占89%，而分子量在5000 Da以上的肽段仅占3.59%（图1）。

图1 牦牛骨胶原蛋白水解物中肽的相对分子质量分布

BALB/c小鼠肠道菌群变化

实验小鼠分为四组，即对照组（NC），低剂量组（LD）、中剂量（MD）组和高剂量组（HD）。每笼每天摄食量为16～23 g，每天每笼饮水量为10～15 g。各组每日食物和水摄入量差异无统计学意义（P＞0.05，LSD检验）。各组小鼠的体重在试验过程中各组之间没有差异。这些结果表明，小鼠在灌胃期间对食物和水没有偏好。

四组之间的物种丰富度（Chao和Ace）没有差异（P＞0.05，Kruskal-Wallis检验）。同时，也没有观察到物种多样性（Shannon和Simpson）的差异（P＞0.05，Kruskal-Wallis检验）。然而，当将LD、MD组的平均水平与对照组NC的平均水平进行比较时发现物种多样性呈下降趋势。通过使用PLS-DA显示了每组之间的β-多样性。结果显示，给小鼠补充YBCH后，各组粪便微生物群的β-多样性存在差异。在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门占粪便微生物群的最大比例，其次是T7，相对丰度低于0.5%的其他门被归类为“其他”（图2A）。结果表明，与NC相比，YBCH灌胃组中拟杆菌的相对丰度（LD、MD和HD分别为（60.16±8.97）%、（62.91±5.24）%和（61.24±10.6）%）显着增加。此外，在给小鼠灌胃YBCH后，厚壁菌门的相对丰度显着降低。LD、MD和HD组中厚壁菌门的相对丰度分别为（36.95±10.3）%、（34.51±4.48）%和（37.31±10.5）%。然而，NC组中厚壁菌门的相对丰度为（51.16±9.19）%（图2C）。因此，在NC组和YBCH饲养组之间，厚壁菌门与拟杆菌门的比例存在显着差异（图2D，P＜0.05，LSD测试）。此外，在厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度上观察到NC组和MD组之间的高度显着差异（P＜0.01，LSD检验）。

图2 小鼠肠道菌群在门水平上的组成

粪便微生物群的预测功能

根据KEGG（京都基因和基因组百科全书）数据库分析粪便微生物群的预测功能。与NC组相比，YBCH组在KEGG代谢途径2级的预测功能差异如图3所示。在LD组中，“其他次级代谢的生物合成”的预测功能显着增加。NC组，“异生素生物降解和代谢”、“细胞运动”和“信号转导”降低。MD组和NC组之间共有8个预测函数存在差异。MD组的“脂质代谢”、“辅因子和维生素的代谢”、“其他次级代谢的生物合成”、“聚糖生物合成与代谢”和“消化系统”的预测功能显着改善，而“细胞运动”、“信号转导”和“转录”减少。观察到HD组的预测功能“异生素生物降解和代谢”降低。

图3 肠道菌群的功能预测

粪便中SCFAs的浓度

表1显示了小鼠粪便中SCFA的浓度。与NC组相比，醋酸、丙酸、异丁酸、丁酸浓度显着升高（P＜0.05，Kruskal-Wallis检验），MD组异戊酸浓度显着升高增加（P＜0.01，Kruskal-Wallis检验）。MD组乙酸、丙酸和丁酸浓度分别比NC组增加79.7%、89.2%和78.8%。与NC组相比，HD组异丁酸水平升高（P＜0.05，Kruskal-Wallis检验）。NC组与LD组无差异。

表1 各组粪便中SCFA浓度（μmol/g）

Conclusion
本研究考查了YBCH对BALB/c小鼠肠道微生物群组成和SCFAs产生的影响。结果表明，在YBCH饲喂后，肠道菌群中两个重要属（毛螺菌科和S24-7）的相对丰度发生了变化，并且SCFA的产量增加。此外，预测MD组的脂质和聚糖代谢功能将得到增强。未来，应进一步研究这些变化对小鼠代谢表型的实际影响。

第一作者

郭自涛，江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程中心助理研究员。主要从事活性物质生物制造及功能评价相关领域的应用基础研究及技术开发。近3年以第一作者或共同通讯作者在Food Research International、Food & Function、Journal of Functional Food、Food Bioscience等国际期刊发表论文6篇，中文核心期刊论文3篇。主持国家重点研发计划项目子课题1项，江苏省博士后科研资助项目1项。
通信作者

张梁，江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心教授、博士生导师、校长办公室主任。主要从事活性物质生物制造、环境生物修复、发酵过程工程相关领域的应用基础研究及应用技术开发，主持承担了国家自然科学基金、国家“863”计划目标导向课题等国家级课题6项、江苏省工业前瞻性项目、陆军预研等省部级课题十余项，发表SCI论文60余篇；申请国家发明专利70余项，其中已获授权37项；申请国际专利8项，其中已获美国、欧洲等专利授权4项；参编“十一五”、“十二五”国家规划教材2部；荣获省部级科技奖励2项。获得江苏省杰出青年基金和霍英东青年教师基金，入选江苏省“六大人才高峰”计划、教育部“新世纪优秀人才计划”和江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师培养计划。获聘中国酒业协会酒精分会技术委员会委员、中国粮油学会玉米深加工分会理事、江苏生态学会理事等。

Supplementation with yak (Bos grunniens) bone collagen hydrolysate altered the structure of gut microbiota and elevated short-chain fatty acid production in mice

Zitao Guo^a,b, Dalong Yi^c, Bo Hu^d, Lingyu Zhu^a,b, Ji Zhang^a,b, Yuliang Yang^a,b, Chunyu Liu^a,b, Yi Shi^a,b, Zhenghua Gu^a,b, Yu Xin^a,b, Huaigao Liu^c, Liang Zhang^a,b,*
^a National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
^b Jiangsu Provincial Research Center for Bioactive Product Processing Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
^cAnhui Guotai Biotechnology Co., Ltd, Xuancheng 242100, China
^d National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
*Corresponding author.
Abstract
In this study, yak bone collagen hydrolysate (YBCH) was produced by mixed proteases and provided to standard-diet mice at a different dose (low dose (LD), medium dose (MD), and high dose (HD)) to investigate its effects on the composition of gut microbiota and short-chain fatty acids (SCFA) production. It was found that YBCH was mainly composed of small molecular peptides whose molecular weight below 2000 Da. Notably, supplementation with different doses of YBCH could significantly downregulate the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes in the fecal microbiota. At the family level, the Lachnospiraceae abundance was significantly reduced in the YBCH gavage groups (mean reduction ratio 41.7%, 35.2%, and 36.4% for LD, MD, and HD group, respectively). The predicted functions of gut microbes in the MD group were significantly increased at “lipid metabolism” and “glycan biosynthesis and metabolism”. Moreover, the SCFA production in the YBCH groups was elevated. Especially, the concentration of acetic acid, propionic acid, and butyric acid in the MD group was separately increased 79.7%, 89.2%, and 78.8% than that in the NC group. These results indicated that YBCH might be applied in the development of functional food for intestinal microecological regulation.
Reference:
GUO Z T, YI D L, HU B, et al. Supplementation with yak (Bos grunniens) bone collagen hydrolysate altered the structure of gut microbiota and elevated short-chain fatty acid production in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1637-1645. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.017.