食品界

FSHW | 膳食干预植物乳杆菌KX041可缓解结肠炎相关结肠肿瘤的发生并调节肠道菌群

Introduction

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因。目前，现有的治疗方案，包括放疗、化疗和免疫治疗，可能会引起严重的不良反应，且不能作为日常预防CRC的常规手段。因此，有必要寻找一些安全有效，防治一体的新策略。

在CRC的致病因素中，遗传因素导致的CRC仅占12%~35%，因此，肠道肿瘤的形成主要与一些外部因素有关，如肠道菌群、饮食和生活方式的改变。近年来，肠道菌群在CRC的发生发展中所扮演的角色受到大家越来越多的关注。在我们胃肠道中定殖的微生物高达100万亿个，这些微生物在维持宿主肠道屏障功能、调节炎症、免疫和氧化应激方面发挥着重要作用。研究表明，肠道菌群的改变可以缓解或加重肠道相关疾病的发生发展，例如溃疡性结肠炎及其相关的CRC。益生菌（尤其是Lactobacillus和Bifidobacterium）作为肠道菌群的重要组成部分，在降低CRC发病率和死亡率方面拥有巨大的潜力。例如，研究发现，Lactobacillus bulgaricus可以通过改善CRC小鼠肠道炎症反应来抑制肠道肿瘤形成；Lactobacillus salivarius Ren可抑制结肠肿瘤细胞的增殖；此外，Lactobacillus acidophilus已被证实可显著改善CRC患者的肠道功能恢复能力。总体来说，益生菌缓解CRC作用方式可以概括为（1）提高宿主免疫防御能力；(2）灭活致癌化合物；(3）调节肠道菌群；(4）调节肿瘤细胞的凋亡和分化；(5）减轻肠道屏障损伤，(6）改善氧化应激。

植物乳杆菌 KX041是从我国传统发酵泡菜（重庆开县）中分离得到。前期研究证实，该菌株既产生抗氧化物质（胞外多糖）也产生抗菌物质（细菌素）。作者假设膳食补充植物乳杆菌 KX041可以通过缓解CRC小鼠肠道菌群紊乱及结肠组织氧化应激反应来缓解肠道肿瘤的形成。因此，本研究以植物乳杆菌 KX041作为研究对象，从肠道菌群和氧化应激反应等方面评估该菌株对AOM/DSS诱导的结肠炎相关CRC的缓解作用。

Results and discussion

植物乳杆菌KX041能够缓解CRC小鼠肿瘤的发生发展

本研究采用了单次腹腔注射AOM（10 mg/kg 体重）和3个循环的2% DSS饮水诱导结肠炎相关CRC小鼠（图1A）。由于长期的结肠炎症反应可引发结肠炎相关的CRC的发生发展，所以，首先评估了植物乳杆菌KX041对DSS诱导的炎症反应的影响。结果表明，植物乳杆菌KX041可以部分缓解DAI的升高（图1B）；缓解小鼠结肠组织缩短（图1D）；抑制小鼠胸腺指数减小和脾脏指数增大（图1F和1G）；同时，抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的升高（图1H、1I和1J)。这些数据表明，膳食干预植物乳杆菌KX041可以部分缓解AOM/DSS诱导的炎症反应。

从小鼠结肠组织的代表性宏观图可以看出，AOM/DSS诱导的CRC模型小鼠结肠组织中有多个腺瘤，而膳食干预植物乳杆菌KX041明显降低了小鼠结肠组织中的总肿瘤个数（图1C和1E）。

A，植物乳杆菌的干预方法；B，疾病活动指数；C，小鼠结肠组织代表性宏观图；D，结肠长度；E，肿瘤总数；F，胸腺指数；G，脾脏指数；H，TNF-α；I，IL-1β和J，IL-6的水平。

图1 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导的CRC模型小鼠肠道肿瘤发生的影响

通过对小鼠远端结肠组织进行H&E染色发现，植物乳杆菌KX041干预小鼠的病理损伤症状较少，包括更少的炎症浸润和隐窝损伤（图2A和2D）。此外，阿利新蓝染色结果表明，植物乳杆菌KX041可显著缓解AOM/DSS诱导的小鼠肠黏膜损伤及结肠组织杯状细胞的丢失（图2B和2E）。此外，TUNEL染色结果表明，模型组小鼠结肠组织中的TUNEL阳性细胞的数量显著低于LPK组（图2C和2F）。通过组织病理学分析发现，植物乳杆菌KX041可以缓解AOM/DSS导致的小鼠结肠组织损伤，且促进肿瘤细胞凋亡。

A，H&E染色；B，阿利新蓝染色；C，TUNEL染色；D，组织病理学评分；E，杯状细胞个数；F，TUNEL阳性细胞的个数。

图2 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导CRC小鼠结肠组织病理学变化的影响

植物乳杆菌KX041能够增强CRC小鼠肠道屏障功能

为了研究植物乳杆菌KX041对CRC小鼠肠道屏障功能的影响，本研究使用了FITC-葡聚糖测定小鼠肠道通透性。结果表明，植物乳杆菌KX041干预小鼠血清样本中的FITC-葡聚糖浓度显著低于CRC模型组小鼠（图3A）。此外，植物乳杆菌KX041干预小鼠结肠组织中一些与肠道屏障功能相关的基因（Occludin、Claudin-1和ZO-1）的表达也显著高于CRC模型组小鼠（图3B)。这些结果表明，植物乳杆菌KX041可以部分缓解AOM/DSS对小鼠肠道屏障功能的损害。

A，血清FITC水平；B，Occludin、Claudin-1和ZO-1在小鼠结肠组织中的mRNA水平。

图3 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导CRC小鼠肠道屏障完整性的影响。

植物乳杆菌KX041能够缓解CRC小鼠氧化应激反应

氧化应激反应是导致CRC的主要原因之一。AOM/DSS诱导后，CRC模型组小鼠的血清MDA和MPO水平显著升高（图4A和4B），并且部分抗氧化物质（如GSH和SOD）的水平显著降低，但是，这些不利变化在植物乳杆菌KX041干预小鼠体内均得到了显著缓解（图4C-4G)。此外，膳食干预植物乳杆菌KX041可以显著增加Nrf2和HO-1的表达（图4H）。因此，植物乳杆菌KX041能够缓解AOM/DSS诱导的CRC小鼠的氧化应激反应。

A，血清MDA；B，血清MPO；C，血清SH；D，血清GSH；E，结肠GSH；F，血清SOD；G，结肠SOD；H，Nrf2和HO-1的mRNA水平。

图4 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导CRC小鼠氧化应激的影响

植物乳杆菌KX041能够调节CRC小鼠肠道菌群

肠道菌群的改变能够促进或缓解CRC的发生发展。因此，本研究接着分析了植物乳杆菌KX041对CRC小鼠肠道菌群的影响。由Rarefaction和Shannon可以看出，小鼠粪便样品中大部分的细菌多样性被捕获（图5A）。肠道菌群Alpha和Beta多样性分析结果表明，膳食干预植物乳杆菌KX041可以调节小鼠菌群多样性（图5B-D）。门水平的物种丰度结果表明，与Ctrl组相比，AOM/DSS导致Bacteroidetes、Proteobacteria、Patescibacteria、Tenericutes和Deferribacteres的相对丰度显著升高，而Verrucomicrobia、Actinobacteria和Epsilonbacteraeota的相对丰度显著降低（图5E）。除了Bacteroidetes外，膳食干预植物乳杆菌KX041能够显著逆转Verrucomicrobia、Patescibacteria和Tenericutes的变化。但是，Actinobacteria、Proteobacteria、Epsilonbacteraeota和Deferribacteres的变化在植物乳杆菌KX041干预小鼠肠道菌群中却进一步加剧（图5E）。属水平的物种丰度表明，在3组小鼠中，有11个属存在显著性差异。例如，AOM/DSS导致Lactobacillus和Bifidobacterium的相对丰度显著降低，而uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Turicibacter、 Candidatus_Saccharimonas和uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39的相对丰度显著增加（图5F）。与CRC模型鼠相比，植物乳杆菌KX041干预鼠肠道菌群中的Akkermansia相对丰度显著增加，而uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Turicibacter、Ruminococcaceae_UCG-014、Candidatus_Saccharimonas、Coriobacteriaceae_UCG-002、Enterorhabdus、Parasutterella和uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39的相对丰度显著降低（图5F）。

A，稀疏曲线和香农曲线；B，肠道菌群的α多样性指数，包括ACE、Chao、Shannon和Simpson分析；C，基于Bray-Curtis分析的PCoA；D，OTU级别的层次聚类树；E，门水平；F，属水平。

图5 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导CRC小鼠肠道菌群的影响。

肠道菌群与CRC相关参数之间的相关性分析表明，Bifidobacterium、Lactobacillus和Akkermansia可能具有缓解CRC的作用，因为它们与可能具有加剧CRC发生发展的相关参数（如DAI、组织病理学评分、肿瘤总数、肠道通透性、LPS、MDA、MPO和促炎因子等）呈部分负相关，而与一些可能具有缓解CRC发生发展的相关参数（如GSH、SOD、结肠长度、杯状细胞数和SCFAs）呈部分正相关。相反，其它属（如Turicibacter、Candidatus_Saccharimonas、Coriobacteriaceae_UCG-002和uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39）与可能与具有加剧CRC发生发展的相关参数呈部分正相关，而与可能具有缓解CRC发生发展的相关参数呈部分负相关（图6A）。

为了进一步分析各组间的差异物种，本研究对小鼠肠道菌群进行了LEfSe分析。结果表明，Ctrl组的差异物种为Lactobacillus和Bifidobacterium；CRC模型组的差异物种为Parasutterella、unculture_bacterium_o_Mollicutes_RF39、Marvinbryantia、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Eubacterium_nodatum_group、Turicibacter、uncultured_bacerium_f_Muribaculaceae和Coriobacteriaceae_UCG_002；而植物乳杆菌KX041干预组的差异物种为Akkermansia。

A，肠道菌群与CRC参数的相关性分析；B，不同组间肠道微生物群的LEfSe进化枝图。

图6 植物乳杆菌KX041干预的肠道菌群与CRC之间的关系

植物乳杆菌KX041能够促进CRC小鼠粪便SCFAs水平，降低血清LPS水平

由于SCFAs可以通过多种途径缓解CRC的发生发展，因此本研究进一步评估了植物乳杆菌KX041对CRC小鼠粪便SCFAs的影响。结果表明，乙酸、丙酸和丁酸是小鼠粪便中的三种主要SCFAs（图7A和7B）。与Ctrl组相比，CRC模型组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸水平显著降低，而膳食干预植物乳杆菌KX041可以部分缓解这些SCFAs的降低，尤其是丁酸（图7A）。LPS是革兰氏阴性菌细胞膜的重要组成成分，是TRL4受体的激活剂，能够激发NF-κB炎症通过的过表达。膳食干预植物乳杆菌KX041也能够显著降低CRC小鼠血清LPS水平（图7C）。这些结果表明，植物乳杆菌KX041的抗肿瘤作用可能部分归因于其增加抗炎物质SCFAs水平，而降低促炎物质LPS水平。

A，单一SCFAs水平；B，总SCFAs水平。

图7 植物乳杆菌KX041对AOM/DSS诱导CRC小鼠粪便SCFAs和血清LPS的影响

Conclusion

本研究表明，膳食补充植物乳杆菌KX041可以缓解AOM/DSS诱导小鼠结肠组织中肿瘤的发生发展。植物乳杆菌KX041能够调节CRC小鼠的肠道菌群，促进抗炎微生物（如SCFAs产生菌，Akkermansia）的富集，抑制促炎微生物（如LPS产生菌）的生长，进而增加小鼠粪便SCFAs水平，抑制血清LPS的水平。此外，植物乳杆菌KX041还能够通过增强宿主肠道屏障功能，减轻宿主炎症反应和氧化应激反应来缓解CRC的发生发展。本研究为开发植物乳杆菌KX041膳食补充剂来缓解CRC提供了理论基础。

作者简介

第一作者

汪涛，西北农林科技大学食品科学与工程学院博士研究生。研究方向为食品营养与健康，主要从事益生菌的健康效应研究。攻读博士学位期间已发表SCI学术论文9篇，并参编英文专著1部。

通信作者

刘变芳，西北农林科技大学食品科学与工程学院，副教授，博士生导师。主持国家自然科学基金面上项目、陕西省自然基金、攻关项目、横向合作等多项科研课题，参编《食品微生物学》、《食品生物技术》等教材5部，发表论文30余篇。主要研究方向为食品微生物学，从事食品安全及食源性致病菌的检测防治及其致病机理研究，细菌生物膜形成及其机理研究，益生菌及其菌剂研制。

王欣，西北农林科技大学食品科学与工程学院，副教授，硕士生导师。从事功能多糖以及食品加工废弃物的资源化利用研究工作。目前围绕多糖的清洁制备、分离纯化、结构表征、功能评价、检测方法开发，以及木质纤维的资源化利用等方面，已发表学术论文20余篇，其中以第一作者或通讯作者发表SCI论文10篇，ESI高被引论文1篇，申请发明专利2项，主持国家自然基金，深圳自由探索基础研究，中央高校专项基金和企业横向等科研项目。

吕欣，西北农林科技大学食品科学与工程学院，教授，院长兼测试中心主任。陕西省食品安全专家委员会委员（兼食品安全检测技术专业委员会副主任），西北农林科技大学第五届学术委员会委员，农业农村部食品质量监督检验测试中心（杨凌）常务副主任，农业农村部植物新品种测试（杨凌）分中心常务副主任，陕西省食品科学技术学会副理事长，陕西省食品产学研协同创新联盟理事长，陕西省检验检测产业技术创新战略联盟副理事长，中国酿酒原料及品质安全研究院副院长。担任国家人才项目评审专家、国家自然科学基金评审专家、中国农学会成果评价专家、中国微生物学会会员等，《食品科学》青年编委。主持公益性行业（农业）科研专项（首席专家）、国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、陕西省农业科技创新项目、教育部留学回国人员科研启动基金和陕西中烟工业有限公司重大专项等。发表论文130余篇，申请国家发明专利8项（授权7项，产业化3项）。致力于采用现代分子生物学与发酵工程理论和技术解决生产中的基础和应用问题。

Dietary Lactiplantibacillus plantarum KX041 attenuates colitis-associated tumorigenesis and modulates gut microbiota

Tao Wang^a,b, Panpan Wang^a, Li Yin^a, Xiuchao Wang^a, Yuanyuan Shan^a, Yanglei Yi^a, Yuan Zhou^a, Bianfang Liu^a,*, Xin Wang^a,*, Xin Lü^a,^*

^a College of Food Science and Engineering, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China

^b Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China

*Corresponding authors.

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers and supplementation of probiotics may be a promising intervention method. The present study aimed to investigate the anti-CRC effects of Lactiplantibacillus plantarum KX041 on a CRC mouse model. The CRC mice were induced by 10 mg/kg azoxymethane and 2 % dextran sulfate sodium. L. plantarum KX041 was orally administrated once daily (1 × 109 CFU/mouse). Results showed that L. plantarum KX041 could significantly inhibit inflammation, tumor formation, and induce tumor cells apoptosis. Moreover, this probiotic could ameliorate the damage of intestinal barrier by recovering tight junction protein expression (like Occludin, Claudin-1, and ZO-1) and preventing goblet cell loss. Furthermore, the oxidative stress was alleviated by increasing the level of antioxidant mediators (like GSH and SOD) and reducing the level of oxidative mediators (like MDA and MPO). In addition, treatment with L. plantarum KX041 could directly regulate gut microbiota, thereby increasing the abundance of beneficial bacteria (like SCFAs-producing bacteria, Akkermansia) and decreasing the abundance of harmful bacteria (like pro-inflammatory bacteria, Parasutterella), which in turn raised SCFAs levels and lowered LPS levels. In conclusion, L. plantarum KX041 could effectively ameliorate CRC via reshaping intestinal microenvironment, alleviating inflammation, maintaining intestinal permeability, and attenuating oxidative stress.

Reference:

WANG T, WANG P P, YIN L, et al. Dietary Lactiplantibacillus plantarum KX041 attenuates colitis-associated tumorigenesis and modulates gut microbiotal[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1626-1636. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.012.