食品界

FSHW | 短乳杆菌FZU0713对高脂血症大鼠脂质代谢和肠道菌群的保护作用

Introduction

降低血液中的脂质水平是预防高脂血症的重要手段，研究者致力于寻找新的有效技术和策略来改善或干预高脂血症。乳酸杆菌和双歧杆菌是较为常用和广为人知的改善脂质代谢紊乱的益生菌，短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）是一种异源发酵的革兰氏阳性菌，已被广泛应用于果蔬发酵。肠道菌群是影响宿主能量和脂质代谢的最重要因素之一，益生菌还可以调节肠道微生物生态的平衡，预防或缓解代谢综合征的发生。

本研究试图通过高通量测序技术和基于UPLC-QTOF/MS的肝脏代谢组学结合代谢途径分析，探讨L. brevis FZU0713对高脂饮食（HFD）诱导的高脂血症大鼠肠道菌群和脂质代谢的保护作用及其机制。通过相关性分析和网络可视化，揭示了L. brevis FZU0713的摄入能否改变肠道菌群的组成，以及肠道微生物谱系与脂质代谢参数之间的联系，为开发改善高脂血症的功能性食品提供理论依据。

Results

L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠体重和器官指数的影响

如图1所示，与NFD组（P＜0.05）相比，HFD喂养8周大鼠体重显著增长。然而，通过L. brevis FZU0713的日常干预，显著缓解了由HFD喂养引起的异常生长趋势。此外，HFD喂养大鼠肝脏、肾脏、肾周和附睾脂肪细胞指数显著增加。然而，补充L. brevis FZU0713显著预防了HFD引起的肝脏、肾周和附睾脂肪细胞的异常生长。此外，与HFD组相比，HFD_Sim和HFD_Lb组大鼠肾周和附睾脂肪细胞较小。

图1 L. brevis FZU0713对不同实验组生理指标、肾周和附睾脂肪细胞脂肪蓄积的影响

L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠血清生化参数的影响

实验8周后，与NFD组（P＜0.01）相比，HFD组大鼠血清TC、TG和NEFA水平显著升高（图2）。而口服L. brevis FZU0713显著降低高脂喂养大鼠血清TC、TG和NEFA水平（P＜0.05），表明L. brevis FZU0713可能具有明显降血脂作用。

图2 L. brevis FZU0713对血清的影响

L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠肝脏脂质蓄积的影响

通过测定肝脏脂质代谢相关生化指标进而评价L. brevis FZU0713对肝脏脂质代谢的影响。与NFD组（P＜0.05）相比，HFD组大鼠肝脏（图3A~E）具有更高的TC、TG、TBA、NEFA和脂肪水平（图3A~E）。对L. brevis FZU0713治疗HFD喂养的大鼠，肝脏TC、TG和NEFA水平降低。经H&E染色的组织学分析表明，HFD喂养的大鼠肝脏表现为脂滴积累增加（图3I）。然而，HFD_Lb组的脂肪空泡大小和数量明显小于HFD喂养大鼠，缓解肝脏脂质异常蓄积。此外，L. brevis FZU0713干预可减轻高脂饮食诱导的高脂血症大鼠肝脏氧化损伤（图3F~H）。

图3 L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠肝脏脂质蓄积的影响

L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠粪便脂质和短链脂肪酸水平的影响

与HFD组（P＜0.05）（图4A~C）相比，L. brevis FZU0713干预显著上调了粪便TG和TBA含量，表明其促进粪便中脂质的排泄；补充L. brevis FZU0713显著提高了肠道菌群主要代谢产物丙酸、丁酸、异丁酸戊酸和异戊酸的水平（图4D~I）。

图4 L. brevis FZU0713对HFD喂养大鼠粪便脂质水平的影响

L. brevis FZU0713调节HFD喂养大鼠肠道菌群组成

与NFD组相比，HFD组Romboutsis、Candidatus_Saccharimonas、ChristensenellaceaeR-7组、Atopostupes、norank_o_MollicutesRF39、Turicibacter、Clostridium_Sensitivu_stricto1、瘤胃菌外、毛螺菌科NK4A136组的相对丰度较高，unclassified_f_Lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Coprococcus_2、柯林斯菌属、Blautia和瘤胃球菌属的相对丰度较低，表明高脂饮食喂养的大鼠发生了肠道微生物失调。然而，口服L. brevis FZU0713显著增加了HFD喂养大鼠中Coprococcus_2、Butyricicoccus、Escherichia、Sellimonas、小球菌属、Intestinimonas、毛螺菌科FCS020组和瘤胃菌外的相对丰度，降低了假纤细芽胞杆菌属的相对丰度。

图5 扩展误差条形图比较显著变化属的平均比例的差异和平均比例的差异

肠道微生物类群与脂质代谢参数的相关性

Spearman's相关性分析表明，几种肠道微生物的丰度与脂质代谢参数显著相关（图6）。毛螺菌科FCS020组、小球菌属和Intestinimonas与粪便中TC、TG、戊酸、异戊酸和丁酸含量，肝脏中SOD和GSH-PX活性呈正相关，与血清中TC和TG含量，肝脏中TC、MDA和脂肪含量呈负相关。相反，假纤细芽胞杆菌属与血清TC和TG水平，肝脏TC、TG、NEFA、MDA和脂肪水平呈正相关，与粪便TG、TC、丙酸和异戊酸水平呈负相关（图6B）。此外，Butyricicoccus与肝脏SOD活性呈正相关，与肝脏TBA水平呈负相关。

图6 关键肠道微生物类群与脂质代谢参数之间的Spearman's相关性分析

L. brevis FZU0713对肝脏代谢组学的影响

如图7A、7B、8A和8B所示，在OPLS-DA得分图中L. brevis FZU0713干预8周后肝脏代谢发生明显变化。HFD组大鼠与HFD_Lb组大鼠分离良好，表明口服L. brevis FZU0713可能引起肝脏代谢通路的显著变化。本研究将P值2.0、差异倍数＞2.0、VIP值＞1.0的肝脏代谢物作为HFD和HFD_Lb组（图7C、7D、8C和8D）肝脏代谢组学差异的潜在生物标志物。基于负离子模式（ESI-）下的肝脏代谢组学，在HFD和HFD_Lb组之间的肝脏中共鉴定出19个潜在的生物标志物（图7G），其中与HFD组相比，HFD_Lb组有16个代谢物显著升高，3个代谢物显著降低。与HFD组相比，在正离子模式（ESI+）下成功鉴定了21个潜在的肝脏生物标志物（图8G），其中14个代谢物在HFD_Lb组中显著富集，7个代谢物显著降低。

在ESI-模式下，代谢通路富集结果显示氨基糖和核苷酸糖代谢、烟酸和烟酰胺代谢、果糖和甘露糖代谢、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸生物合成和嘌呤代谢是L. brevis FZU0713（图7E和7F）干预显著改变的主要代谢通路。在ESI+模式下，与HFD诱导的高脂血症大鼠（图8E和8F）相比，初级胆汁酸生物合成、酪氨酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成和氨酰-tRNA生物合成富集为L. brevis FZU0713干预改变的主要代谢途径。

图7 负离子模式下通过UPLC-QTOF MS进行的肝脏代谢组学分析

图8 正离子模式下通过UPLC-QTOF-MS进行的肝脏代谢组学分析

L. brevis FZU0713对肝脏mRNA水平和蛋白表达的影响

如图9A所示，与NFD组大鼠相比，HFD喂养8周诱导肝脏酰基辅酶A氧化酶1和胆固醇7α-羟化酶mRNA表达显著降低，而口服L. brevis FZU0713减弱了该趋势。HFD组大鼠肝脏乙酰辅酶A乙酰转移酶2（Acat2）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hmgcr）、分化簇36（Cd36）和固醇调节元件结合蛋白-1c（Srebp-1c）mRNA水平显著高于NFD组。然而，与HFD喂养的高脂血症大鼠相比，补充L. brevis FZU0713显著降低了Acat2、Hmgcr和Cd36的mRNA水平。本研究通过基于显色检测的免疫组织化学（IHC）进一步评估了参与脂质代谢的关键蛋白的肝脏表达（图9B）。结果表明，口服L. brevis FZU0713抑制大鼠肝脏CD36和SREBP-1C蛋白表达，增加CYP7A1表达，与RT-qPCR结果一致。

图9 L. brevis FZU0713对肝脏mRNA水平和蛋白表达的影响

Discussion

本研究表明，饲粮中添加L. brevis FZU0713可有效预防脂质代谢紊乱，改善肠道菌群失调和肝脏代谢功能。口服L. brevis FZU0713可通过降低大鼠体重增加、血清TC、TG和NEFA水平以及肝脏脂质蓄积，有效缓解HFD诱导的血脂异常。膳食补充L. brevis FZU0713后，HFD喂养大鼠肝组织中脂滴异常积累明显减少甚至消失。减少肝脏脂质蓄积可有效抑制高脂血症和脂肪肝的发生。此外，口服L. brevis FZU0713可有效增加HFD诱导的高脂血症大鼠肝脏胆固醇水平，促进肠道胆汁酸(BAs)的排泄。

基于肠道菌群的属水平分析，发现口服L. brevis FZU0713显著增加了Butyricicoccus、Coprococcus、Intestinimonas,、毛螺菌科FCS020组、Ruminococcaceae_NK4A214组、Ruminococcaceae_UCG-005和UCG-014的比例，Butyricicoccus可能通过产生短链脂肪酸，特别是丁酸，在改善高血糖和高脂血症方面发挥关键作用。在本实验中Butyricicoccus的相对丰度与肝脏TBA水平呈负相关，表明其尤其可能与肝脏胆汁酸生物合成和肠道胆汁酸转化密切相关。此外，肠杆菌与粪便TG、TC和丁酸水平呈正相关。因此推测口服L. brevis FZU0713可能会调节胆汁酸代谢功能，从而显著减少初级胆汁酸产生次级胆汁酸。

基于UPLC-QTOF/MS的肝脏胆酸（CA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）和牛磺胆酸（TCA）代谢组学研究结果表明，L. brevis FZU0713可通过调节高脂血症大鼠肝脏胆汁酸的生物合成和转化，改善脂质代谢紊乱。与HFD组相比，L. brevis FZU0713给药显著上调与脂质和胆固醇合成以及胆汁酸稳态相关的肝脏基因Acox1和Cyp7a1的mRNA水平。此外，给予L. brevis FZU0713显著降低肝脏Cd36、Srebp-1c、Acat2和Hmgcr基因的表达。

在本研究中，L. brevis FZU0713干预通过降低HFD喂养大鼠体内高水平的Cd36来阻止非酯化脂肪酸（NEFA）的摄取，此外，SREBPs可以调节肝细胞中胆固醇和脂肪酸合成和摄取相关酶基因的转录水平。除了所分析的基因外，L. brevis FZU0713还可能作用于与脂质代谢相关的其他基因和肝脏中脂质代谢途径以外的其他基因。因此，肝脏中全局基因的表达和调控需要通过转录组学和蛋白质组学进行系统分析。总之，通过RT-qPCR分析，初步推测L. brevis FZU0713对血脂异常的保护作用可能是通过调节参与脂质代谢的肝脏基因的表达来实现的。

Conclusion

在本研究中口服L. brevis FZU0713对HFD喂养的大鼠表现出调节血脂异常和肠道菌群的能力。L. brevis FZU0713干预可显著富集Coprococcus_2、Butyricicoccus、Escherichia Shigella、Sellimonas、小球菌属、Intestinimonas、毛螺菌科FCS020组的比例，但降低了Pseudogracillbacillus的相对丰度。同时，检测肝脏脂质代谢和胆汁酸稳态相关基因mRNA表达水平，结果初步揭示了L. brevis FZU0713可通过调节肠道菌群和肝脏代谢轮廓，尤其是胆汁酸的生物合成和代谢，改善脂质代谢紊乱。还需进一步利用肝脏蛋白质组学、肠道宏基因组学和粪便代谢组学，通过肠道菌群人源化小鼠模型，探究L. brevis FZU0713对脂代谢紊乱的保护机制，为L. brevis FZU0713的临床应用和功能性发酵食品的生产提供帮助。

The protective effects of Levilactobacillus brevis FZU0713 on lipid metabolism and intestinal microbiota in hyperlipidemic rats

Xiaoyun Fan^a,b,1, Qing Zhang^a,b,1, Weiling Guo^a,b,c,1, Qi Wu^a,c, Jinpeng Hu^b, Wenjian Cheng^b, Xucong Lü^a,b,c,*, Pingfan Rao^a, Li Ni^a,d, Youting Chen^d,*, Lijiao Chen^b,*

^a Institute of Food Science and Technology, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China

^b College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

^cJinjiang Food Engineering Research Center, School of Advanced Manufacturing, Fuzhou University, Jinjiang 362200, China

^dDepartment of Hepatopancreatobiliary Surgery, Fujian Research Institute of Abdominal Surgery, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Levilactobacillus brevis FZU0713, a potential probiotic previously isolated from the traditional brewing process of Hongqu rice wine, may have the beneficial effects on improving lipid metabolism. This study aimed to evaluate the in vivo protective effects and possible mechanism of L. brevis FZU0713 on the disturbance of lipid metabolism in hyperlipidemic rats fed a high-fat diet (HFD). Results showed that oral administration of L. brevis FZU0713 could significantly inhibit obesity, ameliorate the lipid metabolism disorder, including serum/liver biochemical parameters and hepatic oxidative stress in HFD-fed rats. Histopathological result also indicated that dietary intervention of L. brevis FZU0713 could reduce the accumulation of lipid droplets in liver induced by 8 weeks HFD feeding. Furthermore, L. brevis FZU0713 intervention significantly increased the fecal levels of short-chain fatty acids (SCFAs, including acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate and isovalerate) in HFD-fed rats, which may be closely related to the changes of intestinal microbial composition and metabolic function. Intestinal microbiota profiling by 16S rRNA gene sequencing revealed that L. brevis FZU0713 intervention significantly altered the relative abundance of Coprococcus, Butyricicoccus, Intestinimonas, Lachnospiraceae FCS020 group, Ruminococcaceae_NK4A214 group, Ruminococcaceae_UCG-005 and UCG-014 at genus levels. Based on Spearman's rank correlation coefficient, serum and liver lipid metabolism related biochemical parameters were positively correlated with genera Ruminococcus, Pediococcus and Lachnospiraceae, but negatively correlated with genera Pseudoflavonifractor, Butyricicoccus and Intestinimonas. Furthermore, liver metabolomics analysis demonstrated that L. brevis FZU0713 had a significant regulatory effect on the composition of liver metabolites in hyperlipidemic rats, especially the levels of some important biomarkers involved in the metabolic pathways of arachidonic acid metabolism, primary bile acid biosynthesis, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, biosynthesis of unsaturated fatty acid, fructose and mannose metabolism, tyrosine metabolism, etc. Additionally, oral administration of L. brevis FZU0713 significantly regulated the mRNA levels of liver genes (including Acat2, Acox1, Hmgcr, Cd36, Srebp-1c and Cyp7a1) involved in lipid metabolism and bile acid homeostasis. In conclusion, our findings provide the evidence that L. brevis FZU0713 has the potential to improve disturbance of lipid metabolism by regulating intestinal microflora and liver metabonomic profile. Therefore, L. brevis FZU0713 may be used as a potential probiotic strain to produce functional food to prevent hyperlipidemia.

Reference:

FAN X Y, ZHANG Q, GUO W L, et al. The protective effects of Levilactobacillus brevis FZU0713 on lipid metabolism and intestinal microbiota in hyperlipidemic rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1646-1659. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.021.