南昌大学食品科学与技术国家重点实验室殷军艺研究员等：不同酸水解条件下葡聚糖生成糠醛类化合物的规律性
2023-07-24作者：来源：责任编辑：食品界
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单糖组成分析结果准确与否，对多糖结构的深入研究有很大影响。单糖组成的测定是将多糖的糖苷键断裂，再采用相关仪器对不同单糖定性定量分析。葡萄糖是自然界最常见的六碳糖之一，多个葡萄糖利用糖苷键连接形成的同型聚糖为葡聚糖。单糖的损失可能是糖类生成了非糖物质，其中糠醛类化合物是碳水化合物在酸性或高温加热环境下通过烯醇化再脱水产生的主要呋喃环化合物，如5-羟甲基-2-糠醛（HMF）、糠醛（FF）、甲基糠醛（MF）。超高效液相色谱是一种仪器构造简单、成本低、易于操作，可单独或同时测定各种基质中的HMF、FF、MF等糠醛类化合物的方法。
南昌大学食品科学与技术国家重点实验室王紫萱、宗鑫妍、殷军艺*等选择葡聚糖及其单糖葡萄糖为研究对象，采用超高效液相色谱定性定量测定不同酸水解体系中的糠醛类化合物（HMF、MF、FF），阐明葡聚糖和葡萄糖生成糠醛类化合物的含量差异和生成规律，以期为多糖水解回收率的损失原因提供参考，为酸水解条件优化提供思路。
1 超高效液相色谱测定糠醛类化合物方法学建立
线性关系分析
为验证超高效液相色谱仪器方法，制备一系列5-羟甲基-2-糠醛（HMF）、糠醛（FF）、甲基糠醛（MF）混合标准溶液，按照设定的色谱条件对标准品进样测试，以确定动态线性范围，如图1所示。 3 种糠醛类化合物的标准曲线根据峰面积与质量浓度计算线性相关系数，如表3所示，在各自的线性范围内，3 种化合物含量与峰面积有良好线性关系，线性相关系数≥0.999 2。
如表4所示，表明本方法对所研究样品的预期质量浓度具有足够的分析灵敏度。同时，日内精密度结果显示，添加3 种标准品后，进样液中的理论最终质量浓度为454.54 ng/mL；经前处理重复进样6 次，HMF、FF、MF的RSD不大于3.98%。日间精密度结果显示，HMF、FF、MF的RSD不大于4.24%。
如表5所示，3 种糠醛类化合物的平均添加回收率在83.03%～121.24%之间，RSD不大于3.98%，能够满足样品中糠醛类化合物含量的常规分析。 基于建立的样品前处理及超高效液相色谱方法，测定未完全酸水解条件、较优酸水解条件、过度酸水解条件下，葡萄糖和葡聚糖随时间延长生成3 种糠醛类化合物的情况。如图2A和3A所示，葡萄糖和葡聚糖在未完全酸水解条件下生成糠醛类化合物较少。因此，后续重点分析较优酸水解条件和过度酸水解条件下，葡聚糖的酸水解规律及3 种糠醛类化合物生成规律分析。
过度酸水解条件较优酸水解条件
在较优酸水解条件下，葡聚糖和葡萄糖生成3 种糠醛类化合物生成情况不尽相同，如图2B和3B所示。葡聚糖水解成单糖的含量及产生HMF的质量浓度都随加热时间延长整体呈先上升后下降趋势。加热2 h时，此时单糖含量显著增加并达到最高值，随着葡聚糖水解至4 h，生成HMF的质量浓度达到最大值2.71 μg/mL，同时检测到微量的FF（0.14 μg/mL）。葡萄糖在4 h时HMF生成的质量浓度达到最大值（2.64 μg/mL），同时检测到0.12 μg/mL的FF。水解至6 h时，HMF含量均明显下降，转化为FF的含量均显著增加，FF生成含量升高至4 h的1.46～1.66 倍。上述结果表示，较优酸水解体系中游离单糖的含量主要影响HMF的生成含量，对FF影响较小。如图2C和3C所示，在过度酸水解条件下，HMF和FF随着水解开始快速产生。葡聚糖产生HMF和FF的质量浓度均呈先上升后下降的趋势，其中葡聚糖水解为单糖的含量及生成HMF的质量浓度都在1 h达到最大值（检测到的葡萄糖质量分数63.77%，HMF为3.71 μg/mL），FF的生成含量在2 h时达到最大值（0.46 μg/mL）。葡萄糖在0.5 h时产生了高质量浓度的HMF（3.70 μg/mL），0.5 h后HMF含量随着水解时间延长减少；与较优酸水解条件相比，生成的糠醛类化合物更快达到最大值，HMF质量浓度较高。此条件下水解2 h后，葡萄糖和葡聚糖生成HMF、FF的质量浓度呈明显下降趋势。但在过度酸水解条件下，2 种糖类生成MF的含量也始终低于LOD。 糠醛类化合物生成速率与碳水化合物的聚合度有关。同时，初始葡萄糖浓度、酸浓度和水的含量，都是影响糖转化为HMF以及HMF速率的因素。对比图2、3结果表明，未完全酸水解条件（0.5 mol/L H2SO4，60 ℃）下，葡萄糖水解5 h时检测到微量HMF，但6 h内葡聚糖的单糖回收率均不高于1.70%，游离单糖含量较低，同时转化为糠醛类化合物的含量低于LOD。在较优酸水解条件（2 mol/L H2SO4，100 ℃）下水解0.5 h时，葡萄糖生成HMF的质量浓度是葡聚糖的1.64 倍；过度酸水解条件（4 mol/L H2SO4，120 ℃）下，葡聚糖水解1 h时生成HMF的质量浓度与葡萄糖在0.5 h生成的质量浓度接近。上述结果表明，葡萄糖在3 种酸水解条件下生成糠醛类化合物的速率均比葡聚糖高。与多聚糖比较，单糖转化为HMF等糠醛类化合物的速度更快。
通过图4阐述了葡萄糖脱水反应生成HMF、FF及MF的可能机理之一。葡聚糖水解为葡萄糖单体后，葡萄糖经过1,2-烯醇化后脱水生成3-脱氧己糖，3-脱氧己糖再脱去2 分子水生成HMF，或脱去2 分子水后再脱去1 分子甲醛生成FF。本研究中，不同酸水解条件下HMF的含量均高于FF，且生成速度最快，如图2B所示，较优酸水解条件下水解4 h，葡萄糖生成了2.64 μg/mL HMF和0.12 μg/mL FF，HMF生成质量浓度为FF的22 倍。结合图4演示的可能机理推测，MF是整个反应中更高级阶段的产物，其中甲酸可能是限制反应继续进行的原因之一。本实验设置的酸水解条件可能不足以促使葡聚糖和葡萄糖生成MF，MF会在更高温度、酸浓度或更长的贮存期下由HMF继续裂解后形成。后续研究中，有必要进一步对MF的生成条件及规律进行探究。 建立并验证了采用HLB固相萃取柱富集糠醛类化合物并使用超高效液相色谱测定其含量的方法，该方法的方法学验证良好，可以实现多糖经酸水解后糠醛类化合物的准确定量分析。将其应用于测定不同酸水解条件下葡萄糖、葡聚糖生成的糠醛化合物，结果表明：未完全酸水解条件（0.5 mol/L H2SO4，60 ℃）、较优酸水解（2 mol/L H2SO4，100 ℃）及过度酸水解条件（4 mol/L H2SO4，120 ℃）下，葡萄糖与葡聚糖产生的糠醛类化合物为HMF和FF，但生成规律有所不同。同时发现相同酸水解条件下，单糖转化为HMF等糠醛类化合物的速度更快。未完全酸水解条件下，葡聚糖的单糖回收率较低，未检测到糠醛类化合物。提高热处理强度以及酸浓度能提高单糖回收率，同时也会加剧糠醛类化合物的生成，其中HMF生成速度与生成含量高于FF。酸水解条件过于剧烈时，单糖回收率下降，同时糠醛类化合物含量增加。本研究中未检测到MF，可能是水解条件还不够剧烈。根据本研究结果，糠醛类化合物可以作为解释多糖在测定单糖组成过程中单糖回收率损失的原因之一。
本文《不同酸水解条件下葡聚糖生成糠醛类化合物的规律性》来源于《食品科学》2023年44卷10期1-7页.作者：王紫萱，宗鑫妍，宋萧萧，殷军艺，聂少平，谢明勇. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221003-015.
