果胶是由半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键相连形成主链，甲醇及12 种单糖与主链相连所形成的杂多糖。果胶酶是一组能够降解果胶的多酶复合体，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶和果胶/果胶酸裂解酶。果胶酶在工业中有多种应用，具有广泛的应用价值。聚半乳糖醛酸酶由于能够以水解方式切割（内切或外切两种方式）果胶主链中的α-1,4-糖苷键，从而表现出最大的脱胶效率，所以是果胶酶的最重要组成成分。酸性聚半乳糖醛酸酶通过降解果蔬细胞壁中的果胶成分，从而促进果蔬细胞内含物的释放，所以被大量应用在果蔬汁榨取工艺过程中。

广西大学生命科学与技术学院的杨成玮和南宁学院食品与质量工程学院的朱婧、程忠*等通过使用溴酚蓝弱酸性培养基（pH 5.5）对桂北果园土壤中的真菌菌株进行筛选，以期获得能够产弱酸性聚半乳糖醛酸酶菌株，并对获得的菌株所产聚半乳糖醛酸酶进行酶学性质表征及评估其在常见于热带、亚热带水果果浆脱胶工艺中的应用效果。本研究将有助于丰富产聚半乳糖醛酸酶的微生物资源库，也为进一步开发热带、亚热带水果加工提供理论依据。

1 高产聚半乳糖醛酸酶菌株的筛选

分泌聚半乳糖醛酸酶的菌株可将初筛培养基中的果胶物质进行分解，形成酸性的半乳糖醛酸分子，从而与溴酚蓝进行反应使初筛培养基中形成淡黄色的水解圈。将初筛得到的菌株重复划线于真菌分离培养基中，直至得到性状稳定的单菌落。将单菌落接种于液体发酵培养基中复筛筛选出1 株产聚半乳糖醛酸酶活力较高的菌株，命名为JP-128，所产生的粗酶液酶活力为29.2 U/mL。该菌株在初筛培养基上形成均匀、较大的淡黄色水解圈如图1所示。

2 菌株鉴定

菌株经过多次分离纯化，如图2所示，在PDA培养基上菌株形态较大、质地粗糙、气生菌丝茂盛呈白绒状，培养基中心产生绿色的分生孢子并进行延伸；结合显微镜观察发现该菌株的分生孢子呈椭圆形、深绿色。通过PCR技术扩增该菌株的ITS序列，长度为608 bp。通过利用NCBI中的BLAST进行同源性比对，获取同源性较高菌株的ITS序列，同时选用外源菌株绿僵菌（Metarhizium anisopliae）（GenBank登录号为AJ608970.1）作为对照。利用MEGA 11软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树见图3，该菌株与拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis）（GenBank登录号为MN602617.1）亲缘关系最近，序列相似度高达94%。因此，结合菌体形态特征和ITS序列比对，菌株被鉴定为拟康宁木霉（GenBank登录号为ON319119.1）。

3 酶的底物特异性实验

拟康宁木霉JP-128菌株所产聚半乳糖醛酸酶的催化活性由底物进行表征。由图4可知，该酶对具有无任何酯化度的聚半乳糖醛酸底物具有最高催化活性，而对酯化度为15%的柑橘皮来源果胶底物具有很低的催化活性，且酶活力为聚半乳糖醛酸底物的8%。结果表明，该酶对聚半乳糖醛酸底物具有很高的特异性。

4 聚半乳糖醛酸酶的酶学特性

4.1 温度对聚半乳糖醛酸酶活力的影响及其热稳定性

如图5所示，该聚半乳糖醛酸酶的最适反应温度为50 ℃，在35～50 ℃范围内，其相对酶活力能保持在75%以上，可以在较广的温度范围内使用。温度超过60 ℃时不利于该酶的酶促反应。图5B表明，酶在40、45 ℃孵育60 min后对酶活性影响较小，依旧能保80%以上的残余酶活力。在50 ℃条件下孵育30 min，酶活力开始缓慢下降；50 ℃孵育30 min后，相对酶活力仍有70%以上，说明该酶具有良好的热稳定性，属于中高温聚半乳糖醛酸酶，适用于果汁加工等相关行业。

4.2 pH值对聚半乳糖醛酸酶活性的影响及其稳定性

如图6所示，该酶在pH 5.0左右时表现最大的酶活性，酶活力在pH 4.5～6.0较高。这与热带和亚热带水果汁的弱酸性范围相似（4.5～6.0），可避免工业生产的调节pH值步骤。该菌株产聚半乳糖醛酸酶在25 ℃、pH 2.5～8.0缓冲溶液处理24 h后，依旧有80%以上的残余酶活力。结果表明，该菌株所产聚半乳糖醛酸酶在pH 2.5～8.0范围内具有稳定性，是一种弱酸性聚半乳糖醛酸酶。

4.3 金属离子对聚半乳糖醛酸酶活力的影响

二价金属离子是许多酶活性所必需，在50 ℃、pH 5.0条件下测定不同金属离子对聚半乳糖醛酸酶催化活性的影响，结果见图7。Zn²⁺、Mg²⁺、Na⁺对酶活力均有激活作用，Ca²⁺对聚半乳糖醛酸酶的活性有一定抑制作用，Cu²⁺、Mn²⁺对酶活力具有强烈抑制作用。

4.4 聚半乳糖醛酸酶的果汁脱胶应用

在食品工业中，酸性聚半乳糖醛酸酶主要用于果汁的提取和澄清。热带和亚热带水果汁的弱酸性范围（pH 4.5～6.0）与该酶的作用pH值和pH值稳定范围相近，会使催化活性增加。因此，对广西本土的5 种亚热带水果香蕉（pH 4.98）、木瓜（pH 5.35）、白心火龙果（pH 4.88）、芭蕉（pH 4.52）、红心火龙果（pH 4.62）的果汁脱胶效果进行应用评估。通过添加0～40 U/mL的聚半乳糖醛酸酶测定不同水果果浆的出汁率和透光率。如图8所示，该酶对5 种水果脱胶均有效果，且随着酶浓度（0～40 U/mL）的增加而越发显著。与对照相比，酶浓度为40 U/mL处理的不同水果出汁率（图8A）分别提高了19.6%、15.4%、12.2%、24.4%、13.6%，透光率（图8B）分别提高了24.3%、13.5%、17.1%、27.8%、31.9%。

如图9所示，不同浓度酶的作用会使果汁黏度呈现不同下降趋势。当加酶量为40 U/mL时，不同水果的黏度下降率分别为82.5%、81.7%、19.6%、81.6%、17.3%，表明该酶对木瓜的作用效果更明显。

木霉属真菌由于其安全性及强大的糖苷水解酶生产能力而被广泛应用于食品与饲料相关酶类，如β-葡聚糖酶、纤维素酶及半纤维素酶等。研究发现拟康宁木霉与大多数木霉属真菌一样具有较强的纤维素酶生产能力，因此有关优化拟康宁木霉发酵条件提高纤维素酶产量的报道相对较多，此外也有研究发现拟康宁木霉能够产几丁质酶、生物脂质。但利用拟康宁木霉生产聚半乳糖醛酸酶却鲜有报道。

5 结论与讨论

本研究利用弱酸性培养基从桂北土壤分离到1 株聚半乳糖醛酸酶生产菌。通过形态学观察、显微镜观察和ITS序列分析，将其鉴定为拟康宁木霉（JP-128）。通过酶学性质分析，该菌株JP-128所产聚半乳糖醛酸酶的最适反应温度为50 ℃，高于聚半乳糖醛酸酶PoxaEnPG28C（45 ℃）、PgaB（40 ℃）、endo-PGI（45 ℃），属于中高温酶。酶的热稳定性实验分析表明该酶在50 ℃处理仍能保留70%以上的残余酶活力，具有较好的热稳定性。酶的最适pH值为5.0，且在pH 6.0仍具有73%最大酶活力。目前报道的绝大多数丝状真菌所产聚半乳糖醛酸酶的最适反应pH值通常小于5.0，如Anand、王恒震和Ázar[等分别报道的黑曲霉、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、蕨氏丽赤壳菌（Calonectria pteridis）所产聚半乳糖醛酸酶的最适反应pH值均为4.0，Yuan Peng等报道的青霉属（Penicillium sp.）所产聚半乳糖醛酸酶的最适反应pH值则为3.5。研究发现菌株JP-128所产聚半乳糖醛酸酶除表现出明显的弱酸性特征外，当该酶在25 ℃不同pH值条件下保温24 h后其在pH 2.5～8.0仍能保持稳定。整体上菌株JP-128所产聚半乳糖醛酸酶具有较好的热稳定性及显著弱酸性反应特征，其最适反应pH值与pH值稳定范围与大多数热带、亚热带水果果浆的pH值（pH 4.5～6.0）相匹配，因此该酶在热带、亚热带水果果浆脱胶中具有应用潜力。