食品界

高血压是以体循坏动脉血压（收缩压和/或舒张压）增高为主要特征的临床综合征，是引起心肌梗死、脑卒中和冠状动脉硬化等疾病的重要危险因素。目前治疗高血压的药物有利尿剂、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、钙拮抗剂等。血管紧张素转换酶（ACE，EC3.4.15.1）是一种广泛存在于肺、睾丸和肾脏中含有Zn²⁺辅基的二肽羧肽酶。在人体血压调节中，ACE对激肽-激肽释放酶系统（KKS）和肾素-血管紧张素系统（RAS）的平衡调节中起着重要作用。降血压肽是一类源自食物蛋白质、具有降低人体血压功能的活性寡肽。它可以通过抑制ACE活性，避免KKS系统中舒缓激肽的失活和减少RAS系统中血管紧张素II的产生，进而降低人体血压。

江南大学食品科学与技术国家重点实验室狄娜娜、江波*，张冉等通过以降血压肽WQVLPNAVPAK为母体肽，设计合成六串联体的多聚体血管紧张素转换酶抑制肽（ACEIP），增加其氨基酸数和分子质量，促进其表达。根据大肠杆菌（Escherichia coli）偏爱密码子优化后的ACEIP基因片段与表达载体pET30a相连，转化至E. coli BL21（DE3）后，构建了基因工程表达菌E. coli BL21（DE3）/pET30a-ACEIP。该工程菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，获得降血压肽ACEIP。这种构建方法可为降血压肽的工业化生产提供可用途径，同时也为其他小分子肽的生产如抗菌肽、降糖肽等提供借鉴，以便促进保健品行业的发展。

1 重组降血压肽ACEIP基因的扩增

以含有重组降血压肽基因ACEIP的pUC57-ACEIP为模板，使用引物ACEIP-F和ACEIP-R对目的基因ACEIP进行PCR扩增，PCR结束后，通过1%的琼脂糖凝胶核酸电泳对产物进行分析，如图1所示，PCR产物在约为240 bp处有一条与重组降血压肽基因ACEIP大小相符的条带。

2 重组质粒pET30a-ACEIP的构建及鉴定

将PCR产物与表达载体pET30a分别用用NdeI和HindIII酶切后，胶回收片段，T₄ DNA连接酶连接过夜，产物化转至E. coli DH5α中，LB平板划线后，挑取单菌落，培养后抽提质粒，用NdeI和HindIII进行双酶切鉴定。另外，挑取10 个单菌落，进行菌落PCR。电泳图谱（图2a）显示，ACEIP基因的条带和表达载体pET30a的片段条带分别在约240 bp和5 256 bp处出现，与用软件预测的理论分子质量相符，证明设计的重组降血压肽基因ACEIP与表达载体pET30a相连成功。而菌落PCR（图2b）的结果表明，以水和空质粒菌株为对比，菌落PCR产物约在相对分子质量为240 bp处有明显条带，进一步证明目的基因被成功克隆到pET30a载体上。

3 重组降血压肽ACEIP的诱导表达

将构建的表达质粒pET30a-ACEIP转化入E. coli BL21（DE3）后，Kan抗性平板筛选阳性单菌落培养，在终浓度为0.8 mmol/L IPTG、37 ℃条件下诱导表达8 h后，离心收集菌体沉淀。超声破碎后，Tricine-SDS-PAGE分析重组降血压肽ACEIP的表达情况，如图3所示，与未含有目的基因ACEIP的工程菌株相比，经过IPTG诱导后，含有ACEIP基因的工程菌在相对分子质量为8.7 kDa处出现与设计的基因大小相符的条带，表明重组蛋白ACEIP成功在大肠杆菌中进行了表达。同时，对超声破碎后的上清液和沉淀进行电泳分析，如图4所示，破碎液离心后的上清液和沉淀中均出现了条带，但在沉淀中的重组降血压肽条带更加明显，且其表达量占到菌体总蛋白的38%，表明ACEIP在E. coli中主要以包涵体表达的形式进行表达，即包涵体表达。

4 重组降血肽ACEIP的纯化

由图4可知，重组降血压肽ACEIP主要是包涵体表达。如图5所示，使用洗涤液I清洗包涵体沉淀后可去除部分的杂蛋白（泳道2），再用包涵体洗涤液II（泳道3）清洗去除EDTA。洗涤后重组降血压肽（泳道4）的纯度上升，为60%。通常溶解包涵体主要使用尿素和盐酸胍等变性剂，但因盐酸胍的价格较为昂贵，而尿素价格相对便宜，且其溶解后没有电离现象产生，除去时不易形成沉淀，因此本研究选用8 mol/L尿素作为溶解液，溶解效果如泳道4所示。目标蛋白溶解度超过80%。

7 讨论与结论

源自食品蛋白质的降血压肽，具备抑制ACE活性的同时，还具有效果专一、无毒、安全性高、只对高血压患者起作用和无不良反应等优点，因此可作为化学合成药的替代品。

利用蛋白酶酶解蛋白质制备降血压肽是最常用的方法，但该法得到的产物成分多且复杂、有效得率低，分离纯化步骤繁琐，进而限制了降血压肽的生产以及产业化。而利用DNA重组技术可以实现对外源蛋白质的高效表达，可有效解决以上问题，并且产品的率高，成分简单和成本低。

降血压肽属于小分子肽，肽链较短，氨基酸数目较少，一般只有几个到十几个氨基酸。当其利用基因工程手段直接表达时，存在易被宿主菌中的蛋白酶降解导致表达量低的问题。本研究选用的降血压肽WQVLPNAVPAK只有11 个氨基酸，直接通过宿主菌表达时也可能存在这些缺点，因此本研究通过串联的方式，将其构建为多聚体ACEIP并转换为基因片段，与表达载体pET30a相连后，构建重组表达菌E. coli BL21（DE3）/pET30a-ACEIP，成功地在E. coli中进行表达且其表达量占到了菌体总蛋白的38%。表达产物经过纯化后，其中融合蛋白的表达量达到61.30 mg/L。而后，该重组蛋白经过肠激酶酶切，去除了其合成序列N端的肠激酶序列（DDDDK）和His标签，获得了纯的串联多肽ACEIP，并从1 L的发酵培养液中得到57.84 mg的ACEIP。串联多肽经过胰蛋白酶水解，IC₅₀为6.39 mg/mL，抑制活性高于单体肽WQVLPNAVPAK的抑制活性，表明串联多肽可得到有效的释放，并且串联的方式使得降血压肽得到了富集，具备更好的降血压效果。从以上研究可见，基因工程法生产降血压肽的不仅有效而且过程短，可为未来研究降血压类药物奠定一定的基础并提供思路，也为功能性食品的发展提供借鉴。

本文《重组降血压肽ACEIP的表达及活性鉴定》来源于《食品科学》2023年44卷10期224-230页.作者：狄娜娜，江波，张冉，曹洪震，陈静静，张涛. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220428-375.