1.BFE对牦牛肉自然发酵香肠羰基含量的影响

羰基可以通过4 种方式在蛋白质中形成：1）赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和脯氨酸侧链的直接氧化；2）非酶糖化；3）通过α-酰胺化途径或通过谷氨酰侧链氧化裂解肽主链；4）与非蛋白质羰基化合物的共价结合。4 种途径中，氨基酸侧链的直接氧化被认为是蛋白质羰基化的主要途径，因此羰基含量越高，代表蛋白质氧化程度越高。由图1可知，随着发酵时间的延长，各处理组的羰基含量整体呈升高趋势，表明蛋白质发生了氧化。发酵过程中，各不同处理组的羰基含量均低于空白对照组；与BHT处理组相比，0.10% BFE对羰基的整体抑制效果更好。另外，有研究显示使用含有酚类化合物的植物提取物能够降低蛋白质氧化速率。

席夫碱类物质是蛋白质的非修饰氨基酸的羰基与侧链氨基之间相互作用的产物。席夫碱会发生自发的分子内重排，转化为早期糖基化产物，一部分早期糖基化产物通过直接的氧化或水解直接生成晚期糖基化终末产物。如图2所示，不同处理组的席夫碱含量均随着发酵时间的延长整体呈上升趋势，不同处理组席夫碱含量显著低于空白对照组（P＜0.05），其中添加量为0.10%BFE处理组对席夫碱形成的抑制作用最显著且优于BHT处理组。

3.BFE对牦牛肉自然发酵香肠总巯基和活性巯基含量的影响

由图3、4可知，不同处理组的总巯基和活性巯基含量随着发酵时间的延长整体呈下降趋势。巯基含量降低的原因可能是自由基攻击蛋白分子导致其空间结构发生改变，促使内部包埋的巯基集团暴露，被氧化形成二硫键。在发酵末期（14 d），各BFE处理组总巯基和活性巯基含量均高于空白对照组及BHT处理组，说明BFE能够有效抑制巯基损失，其中0.10% BFE效果最佳。

4.BFE对牦牛肉自然发酵香肠表面疏水性的影响

如图5所示，不同处理组表面疏水性均随发酵时间延长整体呈上升趋势，不同处理组间具有一定差异。发酵过程中，0.10% BFE处理组表面疏水性显著低于空白对照组以及BHT处理组（P＜0.05），表明BFE具有抑制表面疏水性增加的作用，且与BFE具有剂量依赖效应。

如图6所示，不同处理组在贮藏过程中的二聚酪氨酸含量均整体呈上升趋势，发酵初期与末期各处理组二聚酪氨酸含量差异显著（P＜0.05），这与李琼帅等研究结果相似。这可能是因为在贮藏过程中，蛋白质发生氧化反应，酪氨酸被氧化成二聚酪氨酸，通过共价键和非共价键形成蛋白聚集体，使二聚酪氨酸含量升高，这与本研究SDS-PAGE结果一致。贮藏结束时，不同处理组间二聚酪氨酸含量差异显著（P＜0.05），其中空白对照组的二聚酪氨酸含量最高，为7.148；0.10%BFE处理组二聚酪氨酸含量最低，为4.019。不同处理组均能在牦牛肉自然发酵香肠的不同阶段对二聚酪氨酸的生成有抑制作用，且0.10% BFE处理组二聚酪氨酸含量显著低于BHT处理组（P＜0.05），表明BFE能够抑制蛋白质氧化，减少侧链氨基酸的聚合作用，降低酪氨酸被氧化的概率，从而减少二聚酪氨酸的生成，具有一定抗氧化活性。

6.BFE对牦牛肉自然发酵香肠内源色氨酸荧光的影响

由图7可知，延长牦牛肉肠的发酵时间，色氨酸荧光强度值在各处理组中均出现下降趋势，在发酵末期（14 d）达到最低值。所有样品中，空白对照组荧光强度始终高于其他各处理组，在发酵末期（14 d）BHT处理组荧光强度高于BFE处理组。添加BFE至发酵香肠中会引起色氨酸荧光强度降低，且荧光强度与BFE添加量呈明显的量效关系。可能因为BFE与蛋白质发生相互作用，使得蛋白质空间结构展开，荧光基团暴露于极性环境中，从而降低了荧光强度。BFE中富含酚类物质，多酚可以通过二硫键、氢键、疏水相互作用等方式与蛋白质发生相互作用。有报道显示，酚类物质会增强极性环境，并产生屏蔽效应，从而降低蛋白质荧光强度。

7.BFE对牦牛肉自然发酵香肠蛋白质溶解性的影响

如图8所示，随发酵时间的延长各处理组蛋白溶解性整体呈降低趋势，其中0.10% BFE处理组蛋白溶解性显著高于空白对照组及BHT处理组（P＜0.05），0.10% BFE处理组蛋白溶解性最高，这也与2.4节表面疏水性结果相似。一般来说，溶解性与表面疏水性呈负相关。BFE中酚类物质主要为没食子酸、原儿茶酸等，迷迭香酸、鞣花酸等酚类物质含量较低，这可能是导致溶解性出现差异的原因。

8.BFE对牦牛肉自然发酵香肠二级结构的影响

由图9可知，不同处理组主要吸收峰均在1 700～1 500 cm-1，包括酰胺I带（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II带（1 650～1 500 cm-1），其中酰胺I带是蛋白质二级结构研究的关键吸收带。肉制品的加工和贮藏过程中会伴随α-螺旋的减少和β-转角的增加，二者的变化可以被看作蛋白质氧化的重要评价指标。

如图10所示，随着发酵时间的延长，不同处理组α-螺旋含量整体呈降低趋势，β-转角、无规卷曲含量整体呈升高趋势，0.10% BFE处理组α-螺旋含量整体高于空白对照组，β-转角含量整体低于空白对照组。研究表明，蛋白质氧化会导致α-螺旋结构向β-结构转变，进而导致α-螺旋结构含量降低，α-螺旋结构主要由一个—CO和—NH之间的氢键维持。结合本研究其他指标可知，随着发酵时间的延长蛋白质构象发生改变，各处理组α-螺旋含量降低的原因可能是由于蛋白质发生氧化导致—CO和—NH基团之间的氢键被破坏。有研究报道，α-螺旋和β-折叠的比例越高，蛋白质的二级结构越稳定；β-转角和无规卷曲的比例越高，蛋白质的二级结构越松散。在发酵末期（14 d）不同处理组中，BFE处理组α-螺旋和β-折叠含量最高，表明BFE对蛋白质的二级结构稳定有积极作用，其中添加量为0.10% BFE效果最好。这与提取物中所含的酚类物质有关，酚类物质能够降低α-螺旋的转变程度，有利于维持肌原纤维蛋白的二级结构。

9.BFE对牦牛肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE的影响

如图11所示，随着发酵时间的延长，肌球蛋白重链处条带出现明显扩散，不同处理组之间肌球蛋白重链扩散情况存在明显差异，表明氧化可能导致肌原纤维蛋白产生了分子质量较大的聚集体，使蛋白分子间通过二硫键、二酪氨酸等形成交联，较高条带处出现的模糊和扩散现象说明在牦牛肉香肠在发酵过程中蛋白质发生降解。在低分子质量处出现新的条带以及条带颜色加深的现象也能说明蛋白质分子发生降解，如图11所示，在35～48 kDa处条带不同处理组均出现明显扩散现象，这与Xia Minquan等的研究结果相似，该现象也表明氧化会对肌原纤维蛋白不同部分作用效果相同。BFE中酚类物质通过自身氧化产生醌类物质，从而促进蛋白质中赖氨酸、蛋氨酸、丝氨酸的交联，达到蛋白交联的目的，蛋白的相对分子质量变大，从而使肌球蛋白重链条带减弱。空白对照组肌球蛋白尾部随着发酵时间的延长逐渐消失（图11E），表明发生氧化反应的蛋白质结构充分展开，水解后形成大量的碎片，表现为凝胶底部出现明显条带（图11A、B）。然而添加BFE处理组中，随着发酵时间的延长，肌球蛋白尾部含量也逐渐减少，但条带并未完全消失，说明BFE对肌球蛋白有一定保护作用。