《食品科学》：河北科技大学食品与生物学院王世杰高级工程师等：抗龋齿口腔益生乳酸菌的筛选
2023-08-15作者：来源：责任编辑：食品界
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定期摄入可发酵糖、不良的生活习惯等因素会导致持续低的pH值口腔条件，使得以变异链球菌为主的多种致龋菌定植黏附在牙齿上形成菌斑生物膜，同时内源性细菌产酸，牙釉质被侵蚀、牙齿硬组织脱矿、造成不可逆破坏性伤害的疾病——龋齿。口腔益生菌替代疗法不仅可抑制变异链球菌，防治龋齿，还可以维持口腔微生态平衡。乳酸菌是国际公认安全的益生菌菌株，因此，口腔益生乳酸菌的相关研究受到关注。
河北科技大学食品与生物学院宁亚维、赵忠情、王世杰*等通过安全性评价、口腔定植能力评价、抑菌特性等研究筛选出1 株抑菌性强、安全性高、口腔定植能力强的口腔益生乳酸菌，以期为口腔保健食品的开发提供菌株资源。
采用牛津杯琼脂扩散法从实验室乳酸菌菌种资源库中筛选抑制变异链球菌和戈氏链球菌的菌株，以醋酸氯已定溶液作为阳性对照，表1显示，28 株乳酸菌菌悬液或发酵上清液对变异链球菌和戈氏链球菌都具有抑菌性。 菌体的溶血性会增加患败血症的危险，菌株有无溶血性是评价菌株安全性的指标之一。本研究对上述筛选的28 株具有较高抑菌活性的乳酸菌进行溶血性评价，表2显示，菌株JZ-1、JT3-1、JZ5-3、TY7-3、SG10-1、SM23-2、PM25-2呈现α-溶血，其他21 株菌株无溶血性。选取了无溶血性并且菌株发酵上清液对2 株口腔致病菌抑菌圈直径≥10 mm的16 株乳酸菌初步探究抑菌代谢产物，筛选出抑菌能力强、可产生非有机酸类抑菌代谢产物的乳酸菌菌株。
表3显示，乳酸菌发酵上清液经中和处理后，16 株乳酸菌抑菌能力均有所降低，其中菌株MJ2-1、HB13-1、HB13-2、JZ27-3抑菌能力显著下降（抑菌圈直径减小10 mm以上），尤其是菌株HB13-1、JZ27-3抑菌性消失，说明菌株HB13-1、JZ27-3代谢产生的有机酸发挥了主要抑菌作用，所以菌株HB13-1、JZ27-3不是期望得到的菌株。发酵上清液中加入过氧化氢酶，发现所有菌株抑菌能力均有所降低，其中菌株SG10-2、JZ14-2、MS30-2、NK31-2、JZ33-3抑菌能力显著降低（抑菌圈直径减小8 mm以上），说明乳酸菌代谢产生的过氧化氢发挥了主要抑菌作用，过氧化氢会危害口腔，所以菌株SG10-2、JZ14-2、MS30-2、NK31-2、JZ33-3不是期望得到的菌株。发酵上清液中加入不同种类的蛋白酶后，绝大多数乳酸菌菌株抑菌性消失，但是菌株MJ2-1、SC4-1、JZ5-1、TY7-2、SG11-2、HB13-2、JZ14-1还存在抑菌性。综上，选取了抑菌能力强（发酵上清液对变异链球菌抑菌圈直径≥12 mm）并有可能产生非有机酸类抑菌代谢产物的乳酸菌菌株MJ2-1、SC4-1、JZ5-1、TY7-2、SG11-2、HB13-2、JZ14-1进行进一步筛选。 通过分析乳酸菌发酵终点pH值以评价乳酸菌的产酸性。表4显示，各株乳酸菌发酵终点pH值均高于已应用的口腔益生菌唾液链球菌K12发酵终点pH 3.65，其中乳酸菌TY7-2发酵终点pH值相对较高为4.26，产酸性相对较低，剩余6 株乳酸菌菌悬液以及发酵上清液发酵终点pH值均高于3.65。上述结果表明所筛7 株乳酸菌产酸性较低。
乳酸菌代谢产生有机酸，有机酸长期作用于牙齿可使牙齿脱矿化导致龋齿。通过酸-钼酸盐分光光度法考察乳酸菌代谢产物对牙齿的腐蚀性，以羟基磷灰石模拟牙齿环境。图1显示，7 株乳酸菌发酵上清液处理羟基磷灰石所释放的磷含量均较变异链球菌组低，并且7 株乳酸菌菌株发酵上清液在处理羟基磷灰石2 h时上清液磷含量达到最大。变异链球菌处理4 h后上清液中磷含量仍有上升趋势，与变异链球菌相比，对牙齿腐蚀性最高的乳酸菌SC4-1发酵上清液可使磷质量浓度少产生5.91 μg/mL，表明相对于变异链球菌，7 株乳酸菌对牙齿腐蚀性较弱。7 株乳酸菌中，菌株MJ2-1以及TY7-2对牙齿的腐蚀性相对较低，牙齿腐蚀性结果与上述产酸性结果一致，说明7 株乳酸菌对牙齿的腐蚀性均较低。 本研究按照CLSI药物敏感性评判标准检测了7 株乳酸菌对22 种抗生素的敏感性，结果如表5所示。7 株乳酸菌菌株对链霉素、诺氟沙星、庆大霉素、环丙沙星、依诺沙星、多黏菌素B均不敏感，均对阿莫西林敏感。菌株TY7-2对5 种抗生素敏感，对2 种抗生素中度敏感；菌株MJ2-1和SG11-2同对12 种抗生素不敏感；菌株JZ14-1仅对红霉素、阿莫西林、头孢吡肟3 种抗生素敏感，对8 种抗生素中度敏感；菌株SC4-1、JZ5-1和HB13-2抗生素敏感和中度敏感数量相对较多，其中菌株HB13-2对7 种抗生素敏感，7 种抗生素中度敏感，敏感性抗生素数量为检测抗生素总数量的63.64%。本研究中除菌株TY7-2，另外6 株乳酸菌均对万古霉素不敏感，而乳酸菌抗生素敏感数量标准未有明确规定。综上所述，菌株HB13-2敏感的抗生素数量较多，安全性较高。
如表6所示，除菌株JZ14-1对溶菌酶的最高耐受质量浓度为1.6 mg/mL，其他6 株乳酸菌对溶菌酶最高耐受质量浓度为1.2 mg/mL。研究报道人体口腔中溶菌酶质量浓度为0～57 μg/mL，所以上述结果表明7 株乳酸菌均可耐受溶菌酶。
8 乳酸菌的自聚能力
如图2所示，不同时间7 株乳酸菌自聚能力存在差异，4 h除菌株TY7-2、JZ14-1，另外5 株乳酸菌自聚能力均较强，其中菌株SG11-2为40.36%，菌株HB13-2为28.49%；24 h菌株MJ2-1、SC4-1自聚能力分别为80.48%、80.28%，表明容易形成生物膜对口腔健康不利；菌株SG11-2、HB13-2、JZ14-1的自聚能力分别为65.86%、64.52%、68.89%，较菌株MJ2-1、SC4-1的自聚能力低，较菌株JZ5-1、TY7-2的自聚能力高，表明适于作为口腔益生菌。
由图3可知，7 株乳酸菌中菌株HB13-2具有较高的疏水性为44.00%，显著高于另外6 株乳酸菌；其次为菌株SG11-2，疏水性为25.06%，属于中度疏水性。其他4 株乳酸菌均为低疏水性，其中菌株TY7-2和菌株JZ14-1疏水性只有9.65%和8.22%，表明菌株TY7-2和菌株JZ14-1口腔定植能力较低，这可能与菌株的特异性有关。7 株乳酸菌中菌株HB13-2的疏水性更高为44.00%，表明菌株HB13-2非特异性黏附于口腔的能力更强。表面疏水性结果与上述自聚能力结果一致，即菌株HB13-2在4 h自聚能力为28.49%，24 h自聚能力为64.52%。因此，推测菌株HB13-2可能定植于口腔的能力更强。 由图4可知，菌株MJ2-1和菌株SG11-2具有相对较低的表面酸电荷，分别为17.31%和17.09%；其次是菌株HB13-2，表面酸电荷为20.16%。菌株HB13-2和菌株JZ5-1具有相对较高的表面碱电荷，分别为49.44%和46.08%。综上，菌株HB13-2具有较低的表面酸电荷和较高的表面碱电荷，推测具有较好的口腔定植能力。表面酸碱电荷结果和上述自聚能力、表面疏水性结果一致，显示菌株HB13-2具有良好的口腔定植能力。 采用苯酚-硫酸法测定了乳酸菌发酵36 h后上清液中胞外多糖的产量，由图5可知，菌株MJ2-1、JZ5-1、TY7-2、SG11-2、HB13-2、JZ14-1粗胞外多糖产量在0.2～0.3 mg/mL之间，其中菌株SC4-1胞外多糖含量为0.181 mg/mL，在所筛选菌株中产量最低；菌株HB13-2和JZ14-1产量分别为0.283 mg/mL和0.287 mg/mL，在所有菌株中胞外多糖产量相对较高。上述结果表明菌株HB13-2和菌株JZ14-1更容易黏附定植于口腔中。 如图6所示，7 株乳酸菌生物膜形成能力显著低于变异链球菌生物膜形成能力。其中，菌株MJ2-1、SC4-1、JZ5-1生物膜形成能力较高，这可能和菌株MJ2-1、SC4-1、JZ5-1自聚能力较高相关；菌株SG11-2和菌株HB13-2生物膜形成能力相对较低，和上述自聚能力结果一致，表明菌株SG11-2、HB13-2安全性较高，不易导致龋齿。
本研究探究了7 株乳酸菌和变异链球菌共聚能力，结果如图7所示。随着时间的延长，所有菌株和变异链球菌共聚能力均增强，4 h时菌株TY7-2和变异链球菌共聚能力为12.27%，在所有菌株中与变异链球菌共聚能力最低；其他7 株乳酸菌和变异链球菌共聚能力在22.02%～33.69%；24 h时菌株MJ2-1、SC4-1和变异链球菌共聚能力分别达到81.50%、76.51%；24 h时，菌株JZ5-1、HB13-2和JZ14-1和变异链球菌共聚能力分别为69.19%、67.40%、66.80%，与变异链球菌自聚能力较强。说明本研究中菌株JZ5-1、HB13-2和JZ14-1与变异链球菌共聚能力较强，具有较高的开发潜力。 本研究采用结晶紫染色分光光度法测定了7 株乳酸菌代谢产物对变异链球菌生物膜抑制率。图8显示，菌株HB13-2、MJ2-1、TY7-2、JZ14-1对变异链球菌生物膜抑制率较高分别为59.72%、55.70%、52.30%、51.10%；菌株SC4-1和菌株SG11-2具有中等抑制率分别为45.45%和40.79%；菌株JZ5-1对变异链球菌生物膜抑制率最低为36.95%。结果表明，7 株乳酸菌代谢产物均可抑制变异链球菌生物膜的形成，其中菌株HB13-2抑制率最高为59.72%。综合考虑菌株HB13-2抑菌性强、安全性高、口腔定植能力强、抑制生物膜形成率高等因素，因此，菌株HB13-2具有更好的开发潜力。 对所筛选的口腔益生乳酸菌菌株HB13-2进行16S rDNA分子测序，并通过NCBI数据库进行BLAST比对，根据亲缘关系构建系统发育树（图9）。结果显示菌株HB13-2和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）的同源性最高，为100.00%（表7），因此将菌株命名为植物乳植杆菌HB13-2。
结 论
筛选出了1 株口腔益生乳酸菌HB13-2，该菌株可高效抑制变异链球菌并能抑制其生物膜的形成，具有较好抗龋齿效果；产酸性低，口腔环境耐受性强，安全性高。经16S rDNA测序鉴定为植物乳植杆菌，命名为植物乳植杆菌HB13-2。本研究表明植物乳杆菌HB13-2可作为抗龋齿口腔益生菌，在食品与医药领域具有较高的开发潜力。
本文《抗龋齿口腔益生乳酸菌的筛选》来源于《食品科学》2023年44卷10期195-204页. 作者：宁亚维，赵忠情，孙颖，张东春，司海山，康亚朋，王志新，王世杰. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220613-133.
