FSHW | 3D打印乳酸菌水凝胶：细胞释放动力学和稳定性
2023-08-17作者：来源：责任编辑：食品界
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生物3D打印是3D打印技术的一个重要分支，它是基于“添加制造”的原理，其主要内容是基于计算机辅助设计（CAD）模型加工和制造活性材料的3D结构，包括生物材料、生长因子、细胞。挤出3D生物打印，又称直写墨水（DIW），在3D生物打印过程中，注射器中的生物墨水是由压缩空气、机械活塞或机械螺杆通过喷嘴或针头驱动，然后层层沉积在施工平台上。这项技术的优势之一是能够轻松地向打印机添加额外的注射器，交替输送不同的生物墨水或相同类型的墨水，但封装不同类型的细胞。 将3D打印用于制作食品发酵剂的研究还很少。与微胶囊技术相比，3D打印可以根据微生物生长条件的要求定制个性化的模型，并为它们的生长和繁殖提供更合适的环境。例如，通过不同的需氧量，将不同的微生物组合起来，从而实现产品的定向合成。 细胞在水凝胶中的释放速率对于水凝胶的有效利用非常重要，因为它可以提高水凝胶作为发酵剂的发酵效率。该研究以水凝胶为生物墨水的主要原料，采用生物3D打印技术制备了乳酸菌水凝胶。采用释药动力学模型预测细菌的释药机理，优化释药条件。将乳酸菌水凝胶用于酸奶发酵，对水凝胶的长期稳定性进行了测试，证实了3D生物打印技术在多菌种混合发酵中的优势。
Results and Discussion
剪切黏度特征与恢复行为
从流变学测量中获得了一系列实验样品的剪切黏度分布（图1b）。所有样品都表现出剪切稀化行为，其特征是黏度随剪切速率的增加而降低。这满足了挤出3D打印机的材料要求。图1c显示了所有样品的回收结果，可打印浓度为25%、30%、35%和30%以上的样品在应用高剪切速率后显示快速回收，这使得材料在挤出后黏度迅速增加并保持高形状保真度。相比之下，印刷浓度为20%的样品在测试时间内未能恢复其黏度。此外，30%以上的样品黏度低于30%的样品。因此，添加发酵液会降低样品的打印效果，在30%的样品中添加1%的发酵液可以获得更好的打印效果。
为了验证3D打印在微生物发酵中的优势，测试了不同型号水凝胶在无菌生理盐水中的细菌释放情况。如图1d所示，模型A是3D打印的网格实验室水凝胶，模型B是由模具制成的圆柱形固体实验室水凝胶。在细菌释放的整个过程中，模型A的细菌释放量高于模型B，说明模型B对细菌的释放有阻碍作用，模型B的细菌数量少于模型A。 本实验中使用的水凝胶具有温度敏感型膨胀特性，因此它将在4 °C以下继续膨胀，如图2a所示。为了探讨水凝胶溶胀与细菌释放的关系，评估了不同时间点的水凝胶的重量膨胀率和相应时间点的细菌释放，图2b显示细菌的释放速度与水凝胶的溶胀呈正相关。在4 ℃时，水凝胶的初始细菌释放较快，1.5 h后释放速率下降，4 ℃时水凝胶的重量膨胀率变化较快，在前2 h迅速增大，然后逐渐减小。为了进一步探讨细菌在水凝胶中的释放机理，用四种常用的数学模型对水凝胶的释放数据进行了拟合。如表1所示，Korsmeyer-Peppas模型、Peppas-Sahlin模型和魏布尔模型的拟合效果较好（R2＞0.95）。Korsmeyer-Peppas模型的拟合方程为F＝0.4443t0.506，n＝0.506。对于平面骨架，释放过程取决于聚合物的溶胀和扩散。 用Peppas-Sahlin模型分析了扩散和松弛过程对释药机制的相对贡献。随着释放时间的增加，Fickian扩散贡献（F）减小，而溶胀扩散贡献（R）逐渐增大（图2c）。结果表明，缓释片的释药曲线为抛物线，随着时间的延长，释药速率降低，释药机理遵循Fick扩散定律 综上所述，细菌在水凝胶中的释放机制受扩散和聚合物溶胀的耦合调节。 表1 用Higuchi方程、Korsmeyer-Peppas方程、Peppas-Sahlin方程和威布尔方程分析实验室水凝胶的细胞释放数据 
据水凝胶中细胞的释放机理，选择了对水凝胶溶胀率影响较大的溶胀时间、收缩时间和收缩温度。如图3a所示，当收缩时间为15 min，收缩温度为37 ℃时，溶胀时间越长，水凝胶释放细菌的能力越强。而细菌的释放量在60 min后达到最大，说明水凝胶的释放量已经达到最大值。当溶胀时间为30 min，收缩温度为37 ℃时，随着收缩时间的延长，水凝胶中细菌的释放量先增加后减少，15 min达到最大值，释放量为（8.27±0.18）lg（CFU/g）（图3b）。随着收缩温度的升高，水凝胶的细菌释放量在30～42 ℃没有明显变化，当收缩温度高于50 ℃时，细菌释放量明显减少，这是由于温度升高导致细菌的损伤和活性的降低所致（图3c）。
在单因素实验结果的基础上，确定了溶胀时间（20～60 min）、收缩时间（5～20 min）和收缩温度（30～50 ℃）对细菌释放的优化（表2）。用二次方程建立统计模型，确定最优条件和各组合因素的响应。 从图3D的响应面来看，膨胀时间和收缩时间之间存在显著的交互作用。溶胀时间和收缩时间越大，细菌的释放量越大。相反，膨胀时间与收缩温度、收缩时间与收缩温度之间的交互作用不显著（图3e，3f）。 利用Design-Expert 12.0软件对工艺参数进行优化，得到预测水凝胶释放菌的最佳工艺条件为：溶胀时间60 min，收缩时间20 min，收缩温度37.52 ℃，最大释菌量为8.163 lg（CFU/g）。 为了验证响应面方法计算结果的可靠性，对模型优化的工艺条件进行了验证。考虑到实验的可行性和方便性，选定的工艺参数为：溶胀时间60 min，收缩时间20 min，收缩温度37.5 ℃，收缩3次，水凝胶的释菌量为（8.123±0.04）lg（CFU/g），与最优组合接近，表明该方程与实际测试结果吻合较好。 如图4所示，利用乳酸菌水凝胶制备发酵乳，并对其发酵特性（含水率、表观黏度、双乙酰含量和乙醛含量）进行了研究。
通常选择不同类型的乳酸菌按适当的比例发酵，以生产出具有优良特性的酸奶。为了证明水凝胶的优良性能，将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种常用的乳酸菌添加到两管生物墨水中，并利用3D打印技术在水凝胶网格中交替沉积。通过反复使用复合乳酸菌水凝胶发酵酸奶，测定了酸奶的发酵性能。如图5所示，在重复使用25次后，复合发酵剂的发酵性能没有明显变化，保水性保持在59%～66%，双乙酰含量在1.46～2.93 mg/L左右，乙醛含量在7.07～7.68 mg/L左右，两种乳酸菌按相同比例混合培养反复发酵后，酸奶各项指标逐渐发生变化，其中保水性、双乙酰含量和表观黏度都有不同程度的增加，经过相应的重复次数后保持稳定，乙醛含量略有下降。
图5 乳酸菌水凝胶和液体混合发酵剂重复使用后的发酵性能 为了进一步证明LAB水凝胶的可重用性，使用扫描电子显微镜观察了一次使用水凝胶和100次重复使用水凝胶的表面结构（图6）。只使用一次的水凝胶表面分布着大小不一的孔（图6a）。同样，被重复使用100次的水凝胶表面也分布有孔（图6b）。此外，通过水凝胶横截面的扫描电子显微镜照片，可以看到水凝胶的内部结构，其中含有大量的LaB（图6c，6d）。
为了进一步探索细菌在这种活体材料中的分布，用激光共聚焦显微镜观察了LAB水凝胶的活/死细胞。如图6e和图6g所示，经活细胞染色后，共聚焦显微镜拍摄的LAB水凝胶的3D图像显示，细菌在水凝胶中分布，但表面附近的细菌密度明显高于内部。用活/死细胞染色后，如图6f和6h所示，水凝胶中到处都是死亡细菌和活细菌，但离水凝胶内部越近，活细菌越少，死亡细菌越多。由此推断，细菌在水凝胶中的分布受营养浓度梯度的控制，越靠近表面营养越丰富，活细菌密度越高，为细菌的3D打印提供了理论依据。 本研究制备了一种可印刷、生物相容性好、稳定性好、无毒的生物油墨，并在其中添加了细菌。使用挤出的3D打印机打印嵌入在活细菌中的水凝胶。用三种常用的数学模型对水凝胶的细菌释放数据进行了拟合。结果表明，细菌在水凝胶中的释放机制受Fickian扩散和聚合物溶胀的耦合调节，通过改变水凝胶的溶胀率可以有效地控制细菌的释放速率。经过100次酸奶发酵实验，乳酸菌水凝胶的发酵性能没有明显变化，水凝胶的结构没有受到破坏。此外，细菌在水凝胶中的分布受营养物质浓度梯度的控制，且靠近表面的活性较高。因此，可以通过优化3D打印模型来提高水凝胶的比表面积，从而提高水凝胶的发酵效率。不同实验室共培养的结果表明，基于三维生物印迹水凝胶的空间分离培养比液体混合培养的发酵性能更稳定。 它为不同微生物的共培养提供了合适的生长环境，为提高整体生物催化性能提供了前所未有的机遇。因此，它在利用多种微生物进行发酵生产方面具有良好的应用潜力。3D printed lactic acid bacteria hydrogel: cell release kinetics and stabilityYifei Liua, Xintao Yina, Xiudong Xiab, Zhen Liua, Lifei Chena, Mingsheng Donga,*
a College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
b Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
*Corresponding author.
Abstract
In this study, a new type of 3D printed living biological hydrogel was developed by integrating lactic acid bacteria (LAB) into biocompatible and non-toxic polymer materials. Interestingly, the living materials loaded with LAB can be freeze-dried and reused for more than 100 times. The bio-hydrogel can be used to co-culture different LAB and keep its fermentation performance stable in long-term use. The release kinetics model and response surface method were used to simulate and optimize the bacteria release mode in the bio-hydrogel. The results show that the release of bacteria from hydrogel is regulated by the coupling of Fickian diffusion and polymer swelling. The stability of LAB hydrogel was evaluated by reuse experiments. The images of confocal microscopy and scanning electron microscope showed that the bacteria with high cell viability were distributed in the hydrogel and intact structure of the living hydrogel was maintained after 100 times of reuse as yoghurt starter. In conclusion, the 3D printed LAB bio-hydrogel developed in this study has the advantage of reuse and sustainability, which is expected to open up a new way for the preparation of food culture starter.
LIU Y F, YIN X T, XIA X D, et al. 3D printed lactic acid bacteria hydrogel: cell release kinetics and stability[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 477-487. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.049.
